Patients et échantillons de plasma
Au total, 78 patients EOC ayant subi une résection tumorale ou une chirurgie de réduction primaire à l’hôpital des travailleurs de Tangshan entre mars 2020 et octobre 2022 ont été inscrits dans cette étude rétrospective. Les critères d’inclusion étaient les suivants : tous les patients avaient reçu un diagnostic récent de COE aux stades I à IV de la Fédération internationale de gynécologie et d’obstétrique (FIGO) et étaient aptes à un traitement chirurgical. Une chirurgie de stadification a été réalisée en cas de suspicion de CO à un stade précoce (stade I ou II) afin de déterminer le stade et d’éliminer le cancer. Pour les CO à un stade avancé (stade III ou IV), où le cancer s’est largement propagé, une chirurgie de réduction ou de cytoréduction a été réalisée pour éliminer tout cancer visible. [22]. Il a été confirmé que tous les patients souffraient de COE grâce à un examen pathologique postopératoire.
De plus, 40 patientes du même âge atteintes de tumeurs épithéliales bénignes de l’ovaire (19 cystadénomes séreux bénins, 11 cystadénomes mucineux, 6 tumeurs à cellules acineuses et 4 tératomes matures) et 52 témoins sains (HC) ont été inclus dans l’étude. Les patients EOC ayant reçu un traitement antitumoral avant la chirurgie ont été exclus de l’étude. Les volontaires sains ne présentaient aucune tumeur ni aucune autre maladie immunitaire ou métabolique. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants pour l’utilisation de leurs échantillons de sang. La présente étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche institutionnelle de l’hôpital des travailleurs de Tangshan.
Des échantillons de sang (10 ml) ont été prélevés auprès de chaque participant dans un tube séparateur de plasma et traités en une heure. Le plasma a été obtenu par centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les cellules vivantes et les débris cellulaires. Le surnageant a été collecté et stocké à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
Isolement des exosomes plasmatiques
Les exosomes plasmatiques ont été extraits à l’aide de la méthode d’ultracentrifugation décrite précédemment. [23]. En bref, le plasma a été décongelé à 4 ° C et centrifugé à 3 000 × g pendant 10 min pour éliminer les débris. Le surnageant a ensuite été ultracentrifugé à 10 000 × g pendant 30 min à 4 ° C à l’aide d’une ultracentrifugeuse (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Par la suite, une autre étape d’ultracentrifugation a été réalisée à 100 000 × g pendant 120 min à 4 °C pour enrichir les exosomes. Le culot a été lavé dans 20 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et collecté par ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 120 min à 4 ° C. Après remise en suspension dans du PBS, les exosomes ont été stockés à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
Microscopie électronique à transmission (MET)
Les pastilles d’exosomes ont été décongelées à 4 ° C et remises en suspension dans du PBS. Une suspension de 20 µL a été placée sur une grille de cuivre recouverte de carbone d’un diamètre de 2 nm. Après égouttage avec du papier filtre, les échantillons ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 1% pendant 5 min. La grille a ensuite été lavée cinq fois avec du ddH2O et colorée négativement avec de l’acide phosphotungstique à 3 % à température ambiante pendant 3 min. Après trois lavages supplémentaires avec du ddH2O pendant 15 minutes chacun, la grille a été séchée à l’air à température ambiante pendant 5 à 10 minutes. Les exosomes ont été observés et photographiés au microscope électronique à transmission (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Analyse par Western Blot
Les cellules A2780 et les exosomes dérivés du plasma ont été lysés avec un tampon de lyse par radioimmunoprécipitation (Beyotime, Jiangsu, Chine) et la protéine totale a été obtenue par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Après quantification à l’aide d’un kit de dosage de protéines à l’acide bicinchoninique (BCA) (Beyotime), des quantités égales de protéines cellulaires et exosomales ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur des membranes PVDF (Millipore, Billerica, MA, USA). La membrane a été bloquée avec 10 % de lait dégraissé dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween 20 (TBST) pendant 1 h, puis incubée pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires, notamment anti-GM130 (Abcam ab52649 ; 1 : 1000). anti-HSP70 (Abcam ab2787 ; 1 : 1 000) et anti-CD9 (Abcam ab236630 ; 1 : 1 000). Après trois lavages avec du TBST, la membrane a été incubée avec des anticorps secondaires appropriés conjugués à la HRP : IgG H&L de chèvre anti-lapin (HRP) (Abcam ab97051 ; 1 : 2000) ou IgG H&L de chèvre anti-souris (HRP) (Abcam ab205719 ; 1:2000), selon le cas, pendant 1 h à température ambiante. Enfin, les bandes protéiques ont été visualisées sur des films photographiques à l’aide du kit de chimiluminescence BeyoECL Plus (Beyotime) avec un système électro-chimiluminescent (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA, USA).
Extraction de miARN exosomal, transcription inverse et réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-qPCR)
Le miARN exosomal total a été extrait à l’aide du kit miRNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Allemagne) en suivant le protocole du fabricant. La qualité et la quantité de l’ARN ont été déterminées à l’aide du système Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis) conformément aux procédures standard du fabricant. La quantification du miR-223 exosomal a été évaluée par RT-qPCR. Tout d’abord, le miARN exosomal total a été soumis à une transcription inverse en ADNc à l’aide d’un kit miScript II RT (Qiagen) avec un tampon Hispec, en suivant les instructions du fabricant. En bref, les miARN matures ont été polyadénylés par la poly(A) polymérase et transcrits de manière inverse en ADNc à l’aide d’amorces oligo-dT. La polyadénylation et la transcription inverse ont été réalisées en parallèle dans le même tube. Les amorces oligo-dT ont une ancre dégénérée en 3′ et une séquence d’étiquette universelle à l’extrémité 5′, permettant l’amplification du miARN mature lors de l’étape PCR en temps réel. L’amplification de l’ADNc a été réalisée à l’aide de tests miScript Primer spécifiques à la cible et du kit miScript SYBR Green PCR, qui contient le miScript Universal Primer (amorce inverse) et le QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen), conformément aux instructions du fabricant. Les amorces spécifiques à la cible étaient les suivantes : miR-223 forward, 5′-AGCCGTGTCAGTTTGTCAAAT-3′ ; inverse, 5′-GTGCAGGGGTCCGAGGTC-3′; U6 avant, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ et inverse, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Le système de réaction de 20 µL pour la détection qPCR de miR-223 et U6 contenait 10 µL de 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 2 µL de 10x miScript Universal Primer (amorce inverse), 2 µL de 10x miScript Primer Assay (amorce directe spécifique), 4 µL de dH2O et 2 µL d’ADNc. Les conditions de qPCR étaient les suivantes : pré-dénaturation à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s et recuit/extension à 60 °C pendant 60 s sur un CFX-96 en temps réel. Système de détection PCR (Bio-Rad). Le petit ARN nucléaire U6 (U6 snRNA) a été utilisé comme référence interne et la quantification relative a été calculée à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt, où ΔCt = Ct [miRNA] -Ct [U6].
Dosage du CA125 plasmatique
Les niveaux plasmatiques de CA125 ont été quantifiés à l’aide d’un kit ELISA disponible dans le commerce (R&D Systems) en suivant les instructions du fabricant. En bref, après avoir ajouté 100 µL de diluant pour test RD 1X à chaque puits d’une plaque en bandelette de 96 puits, 100 µL de plasma EDTA standard, témoin ou dilué par 2 ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été incubée pendant 2 h. à température ambiante sur un agitateur de microplaques orbital horizontal. Après avoir lavé chaque puits quatre fois, 200 µL de conjugué CA125 humain ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 h à température ambiante sur l’agitateur. Ensuite, 200 µL de solution de substrat ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 30 min à température ambiante à l’abri de la lumière. Enfin, 50 µL de solution d’arrêt ont été ajoutés à chaque puits. La densité optique (DO) de chaque puits a été déterminée à l’aide d’un lecteur de microplaques réglé à 450 nm en 30 minutes. La concentration de CA125 a été calculée selon la courbe standard.
analyses statistiques
L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de SPSS20.0 (IBM, Chicago, IL, USA) et GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD), sauf indication contraire. L’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour analyser les comparaisons entre plus de deux groupes. Une valeur p ≤ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Une analyse de corrélation de Spearman et une régression linéaire ont été réalisées pour tester la corrélation entre le miR-223 exosomal plasmatique et le CA125 plasmatique. L’analyse de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) et l’aire sous la courbe (AUC) ont été utilisées pour évaluer la valeur diagnostique du miR-223 exosomal plasmatique, du CA125 et de leur combinaison. Les valeurs seuils pour le miR-223 et le CA125 exosomal dans le diagnostic des COE ont été déterminées à l’aide de la méthode Youden, en sélectionnant le seuil auquel l’indice Youden (sensibilité + spécificité – 1) est maximisé.
2024-03-02 09:48:56
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