Test de diagnostic optimisé en séquence pour la détection du virus Ebola

Utilisation humaine et éthique

Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur, et tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par un comité institutionnel et un comité approprié et menés conformément aux lois et réglementations du ministère de la Défense des États-Unis, fédérales et étatiques, relatives à la protection des personnes. sujets et adhère aux principes identifiés dans le rapport Belmont. Le Bureau de l’utilisation humaine et de l’éthique de l’USAMRIID a examiné cette étude et les échantillons anonymisés et a déterminé qu’il s’agissait d’une recherche sur un sujet non humain (HP-09-32). Tous les échantillons ont été collectés et anonymisés en Sierra Leone à l’hôpital gouvernemental de Kenema, et les échantillons avaient des identifiants indirects à leur réception. Des échantillons ont été collectés pendant l’épidémie pour effectuer des diagnostics d’urgence et n’ont pas été collectés spécifiquement pour cette étude.

Virus et échantillons

Plusieurs variantes d’EBOV ont été utilisées dans cette étude, notamment Kikwit (UCC# R4317a-T ; GenBank ID MK028855.1), Luebo (UCC# R4521T), Mayinga (UCC# R3831T) et Makona (UCC# R4491T, GenBank ID MH121161.1. ). Tous les virus sont conservés par l’Unified Culture Collection (UCC) de l’Institut de recherche médicale sur les maladies infectieuses de l’armée américaine (USAMRIID). Le surnageant de culture cellulaire contenant des échantillons de virus et de sérum humain a été inactivé à l’aide de TRIzol LS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), et les acides nucléiques totaux ont été isolés à l’aide du kit EZ1 Virus Mini V 2.0 (Qiagen, Valencia, CA) et de l’EZ1 Advanced XL. (Qiagen) selon les recommandations des fabricants. Les échantillons ont été élués dans 90 µl de tampon d’élution et conservés à – 80 ° C jusqu’à utilisation. Un ARN synthétique (BioSyn, Inc., Lewisville, Texas) englobant la région cible du test pour EBOV Beni (GenBank # MK163673), qui présentait un décalage dans l’amorce directe, a été utilisé pour les tests d’inclusivité.

Analyse de séquence EBOV

Toutes les séquences EBOV disponibles dans GenBank au début de cette étude (n = 1996) ont été alignées (paramètres inclus : coût d’ouverture de l’espace = 10,0, coût d’extension de l’espace = 1,0, espacement final gratuit et alignement très précis) et analysées ( Outil de recherche de sites de liaison et de création de fragments pour les amorces et les sondes) à l’aide de CLC Genomics Workbench. Aucune amorce Ebo-TM directe n’a nécessité de modification. Les amorces inverses et la sonde ont été modifiées comme détaillé sur la figure 1. La sonde G9A a été modifiée pour correspondre exactement à EBOV Makona. L’amorce inverse G14A a été modifiée pour correspondre exactement à EBOV Kikwit et Makona. Les amorces inverses G14A et G18A ont été modifiées pour correspondre exactement à EBOV Luebo, et l’amorce inverse G18A a incorporé le mésappariement à l’extrémité 3′ de l’amorce inverse pour EBOV Luebo. Afin d’évaluer l’impact des mésappariements de nucléotides sur les performances du test, le test Ebo-TM a été exécuté comme décrit précédemment.¹⁵ avec différentes combinaisons d’amorce et de sonde.

RT-PCR en temps réel

En bref, 5 µl d’acide nucléique extrait d’EBOV Kikwit, Mayinga, Makona et Luebo ont été analysés en utilisant l’Ebo-TM original tel que développé ou modifié en commutant (1) la sonde avec la sonde G9A, (2) l’Ebo-TM avec la sonde inverse. amorce G14A, et (3) test Ebo-TM avec amorce inverse G14A, G18A. Les tests ont été effectués sur le Roche LightCycler 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) à l’aide du kit RT-PCR SuperScript One-Step (Thermo Fisher Scientific). Les conditions de cyclisme étaient les suivantes : 50 °C pendant 15 min ; 95 °C pendant 5 minutes ; 45 cycles (95 °C × 5 s, 60 °C × 20 s) ; et 40 °C × 30 s. Des lectures de fluorescence ont été prises après chacun des 45 cycles, et un échantillon était considéré comme positif si le cycle de quantification (Cq) était inférieur à 40 cycles. La différence entre le test Ebo-TM et le test modifié (ΔCq) a été déterminée.

Sur la base de l’analyse de séquence, une nouvelle amorce inverse (R2079-1, 5′-CAGTCCGGTCCCARAATRTG) et une nouvelle sonde (p2058A-1, 5′-6FAM-CATGTGCCCSCSCATCGCTGC-TAMRA) ont été conçues. Cette sonde contenait un nucléotide dégénéré supplémentaire (le R) qui a été identifié dans plusieurs isolats d’EBOV nouvellement séquencés soumis à GenBank une fois l’analyse ci-dessus terminée. Le test nouvellement optimisé a été exécuté comme décrit ci-dessus avec l’amorce directe d’origine. Les LOD préliminaires utilisant à la fois le test Ebo-TM et le nouveau test EBO-TM2 ont été déterminées à l’aide d’EBOV Makona, Kikwit, Mayinga et Luebo. Le virus a été dilué en série au 1:10 dans de l’eau exempte de nucléases, et la LOD préliminaire était la concentration la plus basse à laquelle les trois répétitions du test étaient positives. La LOD préliminaire a ensuite été confirmée en exécutant 60 répétitions pour chaque virus à la LOD préliminaire. Si au moins 58/60 répétitions n’étaient pas positives, 60 répétitions étaient répétées à une concentration virale plus élevée jusqu’à ce qu’au moins 58/60 répétitions soient positives.

Des tests d’exclusivité ont été réalisés en utilisant les organismes suivants à raison de 100 pfu/réaction : Virus Soudan [Boniface (UCC# R4142S) and Gulu (UCC# R4389T)]virus Reston H28 (UCC# R4387T), virus Tai Forest (UCC# R4371T, GenBank ID MH121167.1), virus Bundibugyo Ouganda (UCC# R4386T), virus Marburg [Musoke (UCC# R4383T), Ci67(UCC# R4250T), Ravn (UCC# R4374T), and Angola (UCC# R4185T)]virus Lassa Josias [(UCC# R4086T), Weller (UCC# R3983a-T), Macenta (UCC# R4341T), and Pinneo (UCC# R4304T)]virus Mobala (UCC# R4043T), virus du Mozambique (UCC# R3993a-T), virus de la dengue [serotype 1 (WestPac, UCC# R4423), 2(S16803, UCC# R4424), 3 (CH53489, UCC# R4425), and 4 (341750, UCC# R4426)]virus de la fièvre jaune (UCC# R4318T), virus de la fièvre de la vallée du Rift (UCC# RV004a-T), virus du Nil occidental [EG101 (UCC# R4310T) and NY99 (UCC# R4272T)]le virus Chikungunya 008 (UCC# R4215T) et B (UCC# R4261T) et le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo IbAr10200 (UCC# R4401T).

Statistiques

GraphPad Prism 5 a été utilisé pour évaluer l’importance de l’impact des mésappariements de nucléotides sur la détection. La signification a été déterminée à l’aide d’un test t (méthode Holm-Sidak) et une comparaison était considérée comme significative si la différence était inférieure à 0,05.