L’injection intradermique sans aiguille prévient la transmission de la peste porcine africaine, tandis que l’injection intramusculaire à l’aiguille ne le fait pas.

Inoculums infectieux

Le virus de la peste porcine africaine de génotype II utilisé dans cette étude provenait de porcs infectés lors d’une épidémie sur le terrain en Thaïlande en 2021. Les rates de porcs cliniquement atteints ont été pesées et mélangées avec le milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM, Gibco, MA, USA) additionné de 5 × antibiotiques (100 × Antibiotics-antimycotics, Gibco, MA, USA) pour préparer une suspension à 10 % poids par volume (p/v). Le tissu a ensuite été homogénéisé et centrifugé à 4000g pendant 10 min. L’homogénat a été filtré à travers un filtre de taille de pores de 0, 2 μm, traité avec 5 antibiotiques pendant une nuit à 4 ° C et conservé à – 80 ° C jusqu’à son utilisation. Pour préparer les inoculums, la suspension d’homogénat a été diluée en série dix fois avec du DMEM et quantifiée pour le nombre de copies génomiques ASFV par ml en utilisant la qPCR en temps réel comme décrit ci-dessous.

Étudier le design

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches de Thaïlande, selon le protocole revu et approuvé par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Chulalongkorn sous le numéro de protocole 2031015. Tous méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. L’étude est rapportée conformément aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Les expérimentations se sont déroulées dans une ferme expérimentale à haut niveau de biosécurité.

Soixante porcs mâles castrés âgés de 4 semaines ont été achetés à partir d’un troupeau thaïlandais conventionnel indemne d’ASFV, de peste porcine classique et de SDRP, où tous les porcs sont vaccinés au sevrage (3 semaines d’âge) contre le circovirus porcin de type 2 et la pneumonie enzootique. À leur arrivée à l’installation expérimentale, les porcs ont été identifiés individuellement (marqués à l’oreille) puis répartis au hasard en fonction de la stratification par poids en deux ensembles (tableau 1). Les porcs de l’ensemble 1 (n = 12) devaient être utilisés comme semoirs. Ils ont été répartis au hasard en 4 sous-groupes (3 porcs par sous-groupe), pour ne pas être inoculés (contrôle) ou pour être inoculés avec des titres ASFV élevés, modérés ou faibles (sous-groupes ASF-H, ASF-M, ASF-L, respectivement ). Set 2 porcs (n = 48) devaient être utilisés comme sentinelles. Ils ont été appariés selon l’âge avec les porcs de l’ensemble 1, puis répartis au hasard en 8 sous-groupes de 6 porcs chacun, pour être injectés avec un dispositif délibérément non désinfecté utilisé quelques minutes auparavant chez des porcs semeurs virémiques. Pendant toute la durée de l’essai, chaque groupe a été maintenu dans une pièce séparée pendant toute la durée de l’essai, avec un accès gratuit et ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les opérateurs entrant dans les chambres portaient des équipements de protection individuelle et désinfectaient leur équipement à la sortie de chaque chambre.

Au jour 0, les porcs semeurs des groupes ASF-H, ASF-M, ASF-L ont été provoqués par voie oronasale avec 4 mL d’un inoculum (2 mL par voie orale et 1 mL par narine) titrant soit 10⁸dix⁶ou 10¹ nombre de copies/mL, respectivement. Le sous-groupe témoin (ensemble 1) n’a pas été inoculé.

7 jours après la provocation (DPC), tous les porcs des sous-groupes de porcs semeurs ont d’abord reçu une injection intradermique (ID) sur le côté droit du cou avec 0,2 ml de Diluvac^® Forte à l’aide d’un dispositif sans aiguille (IDAL^® 3G, MSD Animal Health, Pays-Bas), puis par voie intramusculaire (IM) injecté sur le côté gauche du cou avec 2 mL de Diluvac^® Forte, en utilisant une aiguille conventionnelle (calibre 18, 1 pouce). Les opérateurs ont pris toutes les précautions pour éviter la contamination croisée des appareils. Par la suite, les mêmes dispositifs – volontairement non désinfectés – ont été utilisés pour injecter aux porcs sentinelles (2 porcs sentinelles par dispositif utilisé sur un seul porc semeur) le même volume de Diluvac^® Forte (0,2 ml pour les injections ID et 2 ml pour les injections IM). Là encore, toutes les précautions ont été prises pour s’assurer qu’aucune surface n’a été touchée par les dispositifs d’injection à l’exception de la peau des porcs sentinelles. Diluvac^® Forte est un adjuvant exclusif pour les vaccins fabriqués par MSD Animal Health, avec une innocuité reconnue chez les porcs. Il a été choisi comme substitut de tout produit de vaccination porcine administré par voie parentérale.

Le principal résultat de l’étude était le statut virémique des porcs, évalué par les valeurs Ct obtenues par qPCR, comme indicateur de la charge virale. Les critères de jugement secondaires étaient la détection de la virémie chez le premier porc au sein d’un sous-groupe sentinelle, reflétant une transmission réussie de l’ASFV, et les niveaux de mortalité au sein de chaque sous-groupe, reflétant une infection transmise par injection réussie et/ou la dynamique de transmission dans la pièce.

Évaluation clinique

Après la provocation (porcs semeurs) ou l’injection (porcs sentinelles), la température rectale, les anomalies cliniques et la mort ont été enregistrées quotidiennement pour chaque porc. La notation clinique a été utilisée pour caractériser la progression de la PPA, comme décrit ailleurs¹⁶. L’évaluation clinique a été effectuée sur tous les animaux jusqu’au point final (score comportemental de 4/4 et/ou score neurologique de 2/2), lorsqu’ils ont été euthanasiés sans cruauté. La cotation clinique et la température rectale ont été réalisées par le même personnel au même moment de la journée pendant toute la durée de l’étude. Tous les porcs survivants à la fin de l’étude ont été euthanasiés sans cruauté à l’aide d’une solution injectable de pentobarbital surdosée. Tous les porcs euthanasiés ont subi une autopsie dans une installation sécurisée dédiée à la ferme expérimentale.

Quantification du nombre de copies génomiques ASFV

Des échantillons de sang ont été prélevés sur tous les porcs à 0, 7, 14, 21, 28 et 35 DPC, et testés pour la présence d’ADN d’ASFV par PCR en temps réel. L’ADN total a été extrait des échantillons à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial (NucleoSpin^® Tissue, Macherey-Nagel, Duren, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. La qualité de l’ADN a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop (Colibri Spectrophotometer^®, Titertek Berthold, Pforzheim, Allemagne). Le nombre de copies d’ASFV a ensuite été quantifié à l’aide d’une qPCR en temps réel (qPCR). Des amorces spécifiques du gène P72 de l’ASFV ont été utilisées ; amorce sens : 5′-CAATAACCTGTTTGTAACCCC TGAAATAC-3′ et amorce antisens : 5′-TGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGA-3′. Chaque réaction qPCR contenait 0,1 μg d’ADN, 0,2 μM de chaque amorce, 2 × qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystems, Londres, Royaume-Uni) et de l’eau déionisée pour donner un volume final de 20 μL. Le profil thermique pour qPCR était de 94 ° C pendant 4 min, suivi de 40 cycles de 94 ° C pendant 45 s, 56 ° C pendant 30 s et acquisition de fluorescence à 72 ° C pendant 45 s. La réaction a été effectuée dans un QuantStudio^®3 Machine de PCR en temps réel (Thermo-Fisher Scientific, Waltman, MA, USA). pGEM^®-T Easy Vector (Promega, WI, USA) contenant le gène P72 inséré d’ASFV a été utilisé pour construire un plasmide standard. Une courbe standard a été générée à l’aide d’un standard de plasmide dilué au 10ème série de 10⁰-dix⁸ copies/μL. Le nombre de copies de l’ADN d’ASFV a été calculé en utilisant une méthode de courbe standard. Une valeur Ct > 35 était considérée comme un résultat négatif.