Les chercheurs présentent le génome médié par CRISPR et le déchiquetage du cancer comme paradigme conceptuel pour traiter les gliomes récurrents

Dans une étude récente publiée dans Rapports de cellulesles chercheurs ont démontré l’élimination groupée et régulièrement intercalée de courtes répétitions palindromiques (CRISPR) des cellules de glioblastome (GBM).

Arrière-plan

Le GBM primaire est une tumeur agressive et difficile à traiter. La survie médiane est de 12 à 15 mois malgré des schémas thérapeutiques multimodaux. Des études ont indiqué une hétérogénéité intra-tumorale étendue, avec des sous-populations de cellules présentant des modèles d’expression génique distincts, des mutations, des états épigénétiques et des aberrations du nombre de copies, ce qui rend également inefficaces les traitements ciblant des processus moléculaires spécifiques.

Le témozolomide (TMZ) est actuellement la chimiothérapie de première ligne pour le GBM, et la sensibilité au TMZ est déterminée par la méthylation de la O-6-méthylguanine-ADN méthyltransférase (MGMT) promoteur. Bien que les traitements à base de TMZ améliorent la survie et entraînent moins d’effets secondaires, la plupart des patients connaissent une progression de la maladie.

TMZ augmente également le taux de mutation somatique et, couplé à la perte des voies de réparation des mésappariements d’ADN (MMR) et à l’instabilité génomique tumorale, il conduit à une hypermutation. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace contre les gliomes hypermutés. Ainsi, des thérapies qui éliminent les cellules GBM, quel que soit leur profil mutationnel, sont nécessaires de toute urgence.

L’étude et les résultats

Dans la présente étude, les chercheurs ont introduit l’excrétion du génome/cancer, une stratégie thérapeutique basée sur CRISPR pour traiter le GBM primaire/récidivant en ciblant des séquences répétées uniques dans les génomes tumoraux. Premièrement, ils ont comparé les GBM primaires et récurrents d’un patient à son génome natif. Le patient a subi une résection chirurgicale, une radiothérapie adjuvante et une chimiothérapie TMZ et a rechuté après 11 mois.

La quantification de la charge mutationnelle tumorale a révélé une médiane de 123 et 217 mutations par mégabase pour le GBM primaire et récurrent, respectivement, classant les deux comme hypermutés. Il y avait respectivement plus de 4 400 et 11 600 mutations codant pour une protéine et 451 484 et 698 557 mutations dans le génome non codant du GBM primaire et récurrent.

Les chercheurs ont calculé la possibilité Streptocoque pyogènes 9 (Cas9) ARN à guide unique (sgRNA) associés à CRISPR dans le génome natif du patient et le GBM primaire et récurrent. Il y avait des centaines de millions de sgRNA possibles dans cet espace cible, appelé « sgRNA-ome », dont une grande proportion avait plusieurs loci cibles. L’équipe a appelé ces sgRNA avec des locus cibles répétitifs sous le nom de sgCIDE (pour CRISPR-jeinduit dmanger par edite).

Ensuite, ils ont sélectionné les 10 meilleurs sgCIDE, comprenant entre 3 000 et 300 000 sites cibles, pour évaluer la capacité de CRISPR-Cas9 à éliminer le GBM en ciblant des séquences répétitives. L’expression stable de Cas9 et des 10 sgCIDE dans les cellules GBM LN-229 et U-251 a provoqué un épuisement cellulaire robuste et rapide, alors que celles exprimant des sgARN non ciblés ne se sont pas épuisées.

Les cellules exprimant Cas9 ont présenté une fragmentation importante du génome 24 heures après la transduction avec les sgCIDE. En outre, l’imagerie quantitative en temps réel des cellules vivantes a indiqué que les sgCIDE provoquaient une inhibition de la croissance le premier jour après la transduction et la mort cellulaire le deuxième jour. Ensuite, l’équipe a testé le déchiquetage du génome dans des GBM sensibles et résistants au TMZ.

Les cellules GBM LN-18 et T98G résistantes à TMZ exprimant Cas9 et sensibles à TMZ LN-229 et U-251 GBM ont été traitées avec TMZ ou transduites avec des vecteurs lentiviraux contenant sgCIDE. La quantification de la viabilité cellulaire a révélé les effets attendus pour les titrages de dose de TMZ, la létalité étant évidente uniquement dans les cellules sensibles au TMZ. En revanche, l’expression des sgCIDE a provoqué une létalité virale dépendante du titre dans les quatre lignées cellulaires, indépendamment du statut de méthylation du MGMT promoteur.

Les tests de formation de colonies ont révélé une réduction d’un à deux logarithmes des colonies dans les cellules U-251 traitées au TMZ par rapport aux cellules traitées au diméthylsulfoxyde (DMSO), alors qu’une réduction de deux à trois logarithmes des colonies a été observée. avec transduction sgCIDE. Néanmoins, certaines cellules transduites par sgCIDE ont survécu et formé des colonies.

Des lignées cellulaires monoclonales de ces clones évadés ont été établies et des vecteurs lentiviraux exprimant le sgRNA et le mCherry ou une version tout-en-un codant pour le sgRNA et le Cas9 marqué par mCherry ont été développés. Le retraitement des clones évadés avec des vecteurs fournissant uniquement un nouveau sgARN n’a pas réussi à provoquer une déplétion cellulaire, alors que le retraitement avec le vecteur tout-en-un a conduit à une ablation cellulaire efficace.

Des investigations supplémentaires ont suggéré que le nombre minimum de DSB requis pour éliminer efficacement une cellule était de 30 pour les sites cibles entièrement complémentaires et de 70 pour ceux présentant un seul mésappariement. Comme les cibles du déchiquetage du génome existent également dans les génomes normaux, les chercheurs ont émis l’hypothèse que les mutations spécifiques au cancer dans les gliomes hypermutés pourraient avoir des séquences uniques qui pourraient être exploitées pour le déchiquetage du génome spécifique du cancer (déchiquetage du cancer).

Le GBM récurrent présentait la signature mutationnelle TMZ caractéristique (conversions élevées de cytosine en thymine) du GBM hypermuté. Ensuite, l’équipe a utilisé une lignée cellulaire récurrente dérivée du GBM pour évaluer si la signature mutationnelle de TMZ pouvait être exploitée pour un ciblage spécifique et une ablation cellulaire. Cette lignée cellulaire dérivée du patient (PDCL), nommée SF11411, présentait une sensibilité similaire au déchiquetage du génome que les autres lignées cellulaires GBM.

Les chercheurs ont identifié 10 sgRNA répétitifs et uniques à la tumeur récurrente. Pour la validation, l’équipe a réalisé un criblage CRISPR à grande échelle dans des astrocytes humains normaux (NHA) et PDCL SF11411. La bibliothèque CRISPR comprenait (environ 5 000) des guides ciblant le génome non codant et codant sur un locus unique ou plusieurs locus, des sgCIDE, des contrôles non ciblants et des références de sphère de sécurité.

Le séquençage de nouvelle génération a été utilisé pour comparer les NHA, et les cellules PDCL ont été transduites en une seule copie avec la bibliothèque CRISPR les jours 1 et 28 après la transduction. Comme prévu, la plupart des sgCIDE étaient épuisés dans les deux lignées cellulaires. Les contrôles non ciblés avaient des effets neutres dans les deux lignées cellulaires, alors que les sgARN répétitifs spécifiques au cancer étaient épuisés uniquement en SF11411 mais enrichis en NHA.

Conclusions

Dans l’ensemble, l’étude a décrit le déchiquetage du génome/cancer médié par CRISPR pour traiter les gliomes récurrents. Le déchiquetage du cancer repose sur le ciblage de locus répétitifs spécifiques à la tumeur, déclenchant la fragmentation du génome médiée par CRISPR et la mort cellulaire induite par des dommages à l’ADN. De plus, le déchiquetage du génome était indépendant de la sensibilité du TMZ et du statut épigénétique des cellules GBM.

La plupart des cellules succombent aux dommages initiaux de l’ADN et les rares évadés peuvent être retraités efficacement. La présence de répétitions spécifiques à la tumeur permet la destruction du cancer en ciblant la signature mutationnelle induite par le traitement. Dans l’ensemble, les résultats présentent une avenue potentielle pour développer des thérapies spécifiques au cancer pour traiter les gliomes hypermutés et d’autres cancers hypermutés.