Cette étude prospective a été menée entre juin 2021 et juin 2023 au service de neurologie de l’hôpital central de Taiyuan et de l’hôpital cardiovasculaire et cérébrovasculaire du Shanxi, situés dans la province du Shanxi. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique en 2021 (No : 2021019) conformément à la Déclaration d’Helsinki, et tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit.
informations générales
L’étude a inclus des patients âgés de 18 à 80 ans atteints d’une maladie cérébrovasculaire ischémique aiguë dans les 4,5 heures suivant son apparition, comme défini dans les lignes directrices européennes de 2018 pour le diagnostic et le traitement de l’AVC ischémique aigu. Les critères d’exclusion étaient l’hémorragie cérébrale ou l’hémorragie sous-arachnoïdienne, l’embolie cérébrale cardiogénique, l’apoplexie cérébrale due à des maladies hématologiques, des tumeurs, etc., des complications graves telles que des maladies hépatiques, rénales, hématopoïétiques, endocriniennes et arthrosiques, des troubles mentaux ou une démence sévère, l’utilisation de lipides. -médicaments réduisant et stabilisant la plaque, médicaments hormonaux et immunosuppresseurs au cours des 3 derniers mois, infection chronique ou active récente et autres maladies graves potentiellement mortelles avec une période de survie attendue <3 mois. Des informations sur les patients ont été collectées, notamment l'âge, le sexe, les antécédents de tabagisme, de consommation d'alcool, d'hypertension, de diabète, de fibrillation auriculaire et d'indicateurs de laboratoire à l'admission tels que la glycémie, la tension artérielle, le cholestérol total, les triglycérides (TG), la densité élevée. le cholestérol des lipoprotéines (HDL), le cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL), l'homocystéine (HCY) et la myéloperoxydase (MPO). De plus, les patients ont été divisés en quatre sous-groupes en fonction du moment du début de l'AVC : sous-groupe 1 (0 : 00-05 : 59) ; sous-groupe 2 (06h00-11h59) ; sous-groupe 3 (12h00-17h59) ; et sous-groupe 4 (18h00-23h59). La durée du prélèvement sanguin dans tous les sous-groupes s'est déroulée dans les délais spécifiés.
Pour contrôler les facteurs de confusion, le groupe témoin était composé d’individus souffrant de vertige vestibulaire périphérique ou d’arthrose cervicale qui étaient appariés en termes d’âge et de sexe au groupe d’étude. Le groupe témoin ne présentait aucun symptôme ni antécédent d’accident vasculaire cérébral ischémique ou d’autres troubles neurodégénératifs et a été testé en utilisant la même méthode de détection au même moment que les groupes d’étude. De plus, tous les patients inscrits n’avaient aucun antécédent de troubles du sommeil ni de voyages récents à travers différents fuseaux horaires.
Score NIHSS
Le score de déficit neurologique du groupe d’étude à l’admission a été évalué à l’aide de l’échelle NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale), les scores étant évalués par deux professionnels qualifiés formés à son utilisation.
Détection des facteurs de stress oxydatif, notamment le malondialdéhyde (MDA) et la superoxyde dismutase (SOD), les facteurs inflammatoires dont l’interleukine-6 (IL-6) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), SIRT1 et BMAL1.
L’étude a initialement collecté 5 ml de sang veineux périphérique de tous les participants dans un tube anticoagulant EDTA avant toute intervention clinique. Les cellules mononucléées ont été isolées sur un établi ultrapropre en une heure en utilisant un protocole consistant à ajouter 1 volume de sang total frais à 3 volumes de lysat érythrocytaire, suivi d’une centrifugation à 450 × g pendant 10 min à 4 ° C pour agglomérer les leucocytes. Deux fois le volume de lysat érythrocytaire a été ajouté et le mélange a été à nouveau centrifugé pour obtenir le culot de leucocytes. Après avoir jeté le surnageant, les cellules isolées ont été placées dans un tube EP de 1,5 ml et conservées à -80 ° C jusqu’à ce que la détection par ELISA et par Western blot soit effectuée.
Les niveaux d’expression des facteurs de stress oxydatifs (par exemple, MDA et SOD) et des facteurs inflammatoires (par exemple, IL-6 et TNF-α) ont été mesurés par ELISA.
Les teneurs en MDA, SOD, IL-6 et TNF-α des échantillons ont été analysées à l’aide du kit ELISA MDA humain, du kit ELISA SOD humain, du kit ELISA IL-6 humain et du kit ELISA TNF-α humain par la méthode de compétition. Des échantillons ont été ajoutés aux puits marqués aux enzymes et préalablement recouverts d’anticorps. Ensuite, des antigènes de reconnaissance marqués à la biotine ont été ajoutés et incubés à 37 ° C pendant 30 min. L’antigène et l’anticorps en phase solide étaient en compétition pour la liaison, formant ainsi un complexe immun. Après lavage avec du PBST pour éliminer l’antigène de biotine non lié, de l’avidine-HRP a été ajoutée et incubée à 37 ° C pendant 30 min. Une fois l’avidine-HRP entièrement combinée à l’antigène biotine, elle a été lavée et les solutions de développement de couleur A et B ont été ajoutées. Le mélange a été incubé à 37 °C pendant 10 min pour développer la couleur. Finalement, la réaction a été terminée par l’ajout de la solution d’arrêt. La valeur OD a été lue et calculée dans les 10 min23.
Western blot pour détecter les niveaux d’expression de SIRT1 et BMAL1
Les monocytes isolés ont été homogénéisés avec de l’azote liquide, puis ajoutés 1 ml de PBS et centrifugés à 500 × g pendant 5 min. Les cellules ont ensuite été brièvement placées dans un bain de glace à puissance maximale (3 × 10 s) et le surnageant résultant a été collecté par centrifugation à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 °C. La concentration en protéines a été déterminée à l’aide de la méthode de quantification des protéines BCA et stockée à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. L’électrophorèse sur gel SDS‒PAGE a été réalisée et les bandes protéiques résultantes ont été transférées sur une membrane PVDF via électrophorèse par transfert. Après avoir bloqué la membrane pendant 1 heure à température ambiante, l’incubation de l’anticorps primaire a été réalisée pendant une nuit à 4 °C. La membrane a ensuite été lavée avec 1 × TBST et incubée avec un anticorps secondaire pendant 60 min. Après avoir lavé la membrane pour éliminer les anticorps secondaires libres, un kit ECL a été utilisé pour visualiser les résultats. La membrane a été imagée à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence. La valeur de gris de la bande WB est analysée à l’aide du logiciel ImageJ.
analyses statistiques
Les données ont été analysées à l’aide des logiciels statistiques SPSS 25.0 et R 4.2.0. Le logiciel Graph Pad Prism 8.0 a été utilisé pour la création graphique, tandis que le logiciel Image J2x a été utilisé pour analyser la valeur de gris de toutes les bandes Western Blot. Suite à un test de normalité, les données de mesure conformes à une distribution normale ont été exprimées sous la forme « X− (moyenne) ± S (SD) ». Deux tests t sur échantillons indépendants ont comparé les moyennes de deux groupes. Les données de distribution asymétrique ont été représentées par M (P25, P75) et comparées à l’aide de tests z. L’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons entre plusieurs groupes, avec un test d’homogénéité de variance effectué. Les données de comptage ont été exprimées en fréquences et en pourcentages (n, %) et analysées à l’aide du test χ2. Des analyses de corrélation entre BMAL1, SIRT1, IL-6, TNF-α, MDA et SOD ont été réalisées par analyse de corrélation de Pearson. Le niveau de test était bilatéral α = 0,05 et P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Les bandes de Western blot ont été analysées par le logiciel ImageJ 2 × pour l'analyse de la valeur de gris.
Approbation éthique
L’étude a été approuvée par le comité d’éthique médicale de l’hôpital central de Taiyuan (numéro d’approbation : 2021019). Nous assurons que cette étude adhère strictement aux principes de la Déclaration d’Helsinki de 1964 et de ses révisions ultérieures. Tout au long du processus de recherche, nous avons suivi les principes d’éthique médicale et nous sommes volontairement conformés aux lois et réglementations nationales en vigueur. Nous respectons l’autonomie des participants et adhérons aux principes de bienfaisance, de non-malfaisance et de justice. Le projet est mené selon le protocole approuvé par le comité d’éthique et le consentement éclairé a été obtenu des participants ou de leurs représentants autorisés. Des procédures complètes de consentement éclairé ont été mises en œuvre pour protéger efficacement les droits et la sécurité des participants.
2024-01-20 09:35:09
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