Conception de l’étude et collecte d’échantillons
Une étude prospective a été réalisée sur les naissances vivantes accouchées entre mars 2020 et janvier 2021. Des échantillons ont été prélevés sur des femmes ayant accouché à l’hôpital Bundang de l’Université nationale de Séoul et sur leurs nouveau-nés. Les femmes présentant des signes vitaux instables ou nécessitant une prise en charge urgente telle qu’une transfusion et les nouveau-nés admis à l’USIN ou présentant des signes vitaux instables après la naissance ont été exclues de l’étude. Les échantillons pour l’analyse du microbiome comprenaient le VD maternel, l’AF, le CB, le GL néonatal et le M. Lorsqu’une femme enceinte était hospitalisée dans l’attente d’un accouchement, l’échantillon VD a été obtenu à l’aide d’un écouvillon en polyester inséré dans le fornix postérieur du vagin, assisté par stérile examen au spéculum. Pour ceux qui avaient subi une césarienne pour l’accouchement ou une amniocentèse pour des indications spécifiques (c’est-à-dire pour la détection d’une inflammation/infection intra-amniotique), environ 10 cc de FA ont été obtenus à l’aide d’une seringue pour l’étude. Pendant l’accouchement, à la fois par césarienne et par voie vaginale, environ 20 cc de CB ont été prélevés à l’aide d’une seringue dans la veine du cordon ombilical immédiatement après le clampage. L’aiguille de la seringue a été directement insérée dans le cordon ombilical au niveau du site de livraison entouré de champs stériles pour minimiser la contamination du champ opératoire. Étant donné que l’élimination du liquide amniotique ou d’un autre liquide de la bouche et de l’estomac du nouveau-né après la naissance fait partie de la prise en charge initiale pour aider les voies respiratoires et stimuler la respiration spontanée, la plupart des nouveau-nés ont reçu des procédures d’aspiration et le liquide a été recueilli dans le flacon d’aspiration (environ 15 ml) a été transporté dans un tube conique pour l’analyse de GL. L’échantillon M, les selles très précoces du nouveau-né, a été soigneusement obtenu dans les 24 heures suivant la naissance à l’aide d’un écouvillon en polyester inséré dans l’anus au fur et à mesure que le nouveau-né se stabilisait après la prise en charge initiale. Nous avons essayé de collecter les cinq échantillons différents de chaque femme et nouveau-né(s), néanmoins, une petite partie des échantillons de paires mère-nouveau-né n’ont pas été obtenus ou ont été manqués pour des raisons cliniques. Le critère de jugement principal était la distribution et la composition du microbiome des échantillons ci-dessus provenant de femmes enceintes et de leurs nouveau-nés. Pour déterminer l’association entre le microbiome de différents compartiments et les facteurs obstétricaux, des dossiers médicaux ont été collectés et soigneusement examinés. Les données comprenaient l’âge maternel, l’âge gestationnel à l’accouchement, le mode d’accouchement (accouchement vaginal ou césarienne), l’utilisation de l’ART, d’autres complications obstétricales et les issues néonatales telles que le sexe et le poids à la naissance.
Approbation éthique et consentement à participer
Cette étude a été réalisée avec le consentement éclairé des participants appropriés conformément à la Déclaration d’Helsinki. Le protocole d’étude a été approuvé par le comité d’examen institutionnel de l’hôpital Bundang de l’université nationale de Séoul (B-1606/350-003).
Isolement d’ADN microbien
L’acide désoxyribonucléique (ADN) microbien a été extrait des échantillons VD, GL, AF et CB avec le kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (Zymo Research, Irvine, CA) et l’échantillon M à l’aide du kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Germantown, MD) selon les instructions du fabricant. En bref, les échantillons ont été lysés enzymatiquement et mécaniquement par perlage, suivi d’un lavage et d’une filtration dans la colonne fournie. Les concentrations d’ADN extrait ont été mesurées à l’aide d’un kit de dosage Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Les quantités totales d’ADN extrait variaient en fonction des types d’échantillons, tels que 1 à 10 ug pour VD, 3 μg pour CB, 30 à 200 ng pour M et 50 ng pour GL et AF. Pour chaque boîte du kit d’extraction d’ADN utilisé, aucun matériel n’a été utilisé comme contrôle négatif. Les blancs ont été traités dans l’ensemble du protocole et analysés.
Amplification du gène ARNr 16S
Le gène de l’acide ribonucléique ribosomal (ARNr) 16S a été amplifié à l’aide du protocole de réaction en chaîne par polymérase (PCR) en deux étapes dans la préparation de la bibliothèque de séquençage métagénomique 16S (Illumina, San Diego, CA). Dans la première étape de PCR, la région hypervariable V3-V4 du gène de l’ARNr 16S a été amplifiée en utilisant 10 ng de chaque échantillon, 10 µM d’amorces 341F/785R et l’ADN polymérase de fusion Herculase II (Agilent, Santa Clara, CA). Dans la séquence d’amorces ci-dessous, la base ‘N’ est sélectionnée parmi n’importe quelle base aléatoire, la base ‘W’ est A ou T, la base ‘H’ est A, C ou T, et la base ‘V’ est A, C ou G.
341F : 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGCWGCAG-3′
785R : 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′
Le cycle PCR a été effectué avec un cycle initial à 95 ° C pendant 3 min, suivi de 25 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s et un cycle d’extension final à 72 ° C pendant 5 minutes. Les amplicons ont été nettoyés avec des billes AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Dans la deuxième PCR, des amorces d’index du kit Nextera DNA CD Index (Illumina, San Diego, CA) ont été ajoutées aux extrémités des amplicons générés dans la première PCR. Le cycle PCR a été effectué avec un cycle initial à 95 ° C pendant 3 min, suivi de dix cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s et un cycle d’extension final à 72 ° C pendant 5 min. Chaque échantillon a été nettoyé avec des billes AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) et élué dans de l’eau sans DNase/RNase UltraPure (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). L’ADN amplifié a été vérifié à l’aide d’un système 2100 Bioanalyzer utilisant un kit Agilent DNA 1000 (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Pour chaque production de bibliothèque, aucun modèle n’a été utilisé comme contrôle négatif.
Séquençage et analyse du gène ARNr 16S
Sur la base de la taille et de la concentration de l’ADN, les amplicons ont été regroupés en quantités équimolaires et dopés avec 30 % de PhiX (Illumina, San Diego, CA). Ceux-ci ont ensuite été séquencés sur la plate-forme Illumina MiSeq à l’aide du kit de réactifs MiSeq V2 à 250 cycles appariés (Illumina, San Diego, CA) et d’un kit de réactifs MiSeq V3 à 300 cycles (Illumina, San Diego, CA). Les contrôles négatifs de l’extraction d’ADN et de la bibliothèque ont été séquencés.
Génération de données de séquençage
Nous avons divisé les échantillons en neuf lots (exécutions 1 à 9) et séquencé la région V3-V4 du gène de l’ARNr 16S à l’aide de machines Illumina MiSeq avec une profondeur cible de 100 000 par échantillon (Fig. S8 supplémentaire). Le séquençage a été effectué avec des lectures appariées de 250 bp pour toutes les exécutions de séquençage à l’exception de la dernière (exécution 9), où le séquençage a été effectué avec des lectures appariées de 300 bp pour des raisons pratiques. Les scores de qualité de lecture pour chaque cycle de séquençage sont présentés dans la Fig. S9 supplémentaire. Le programme bcf2fastq d’Illumina a été utilisé pour démultiplexer les données de séquençage brutes (fichiers BCL) et produire des fichiers FASTQ avant et arrière pour chaque échantillon. Il convient de noter que certains échantillons ont été séquencés plus d’une fois pour évaluer l’impact des effets de lot. Celles-ci comprenaient des “doubles de séquençage” dans lesquels la bibliothèque NGS identique d’un échantillon a été séquencée dans des séries séparées et des “doubles de bibliothèque” dans lesquels plusieurs bibliothèques NGS ont été préparées à partir de l’échantillon identique à des dates différentes, puis séquencées séparément.
Analyse et visualisation des données
Sauf indication contraire, toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de la plate-forme QIIME 2, une puissante plate-forme développée par la communauté pour la bioinformatique du microbiome34. Pour chaque cycle de séquençage, les fichiers FASTQ ont été importés dans QIIME 2 et le plugin DADA235 pour identifier les ASV en coupant les parties de lecture de séquence de mauvaise qualité, en débruitant les lectures coupées, puis en fusionnant les lectures avant et arrière (Fig. S8 supplémentaire). Les ASV observés à partir de séquences de séquençage individuelles ont ensuite été fusionnés en un seul tableau ASV. Pour détecter et éliminer les contaminants potentiels, nous avons exécuté le programme decontam sur nos échantillons, qui recherchait les ASV par lot de séquençage qui apparaissaient à des fréquences plus élevées dans les échantillons à faible concentration et étaient retrouvés à plusieurs reprises dans le contrôle négatif.36. La classification taxonomique a été réalisée à l’aide d’un classificateur Bayes naïf utilisant la base de données SILVA37. Pour visualiser les sorties de QIIME 2, nous avons développé le programme Dokdo (https://github.com/sbslee/dokdo), un package Python open source et sous licence MIT pour l’analyse de séquençage du microbiome à l’aide de QIIME 2. Dokdo utilise en interne l’interface de programmation d’application de QIIME 2 et ne nécessite donc aucune autre dépendance. Dokdo peut être utilisé pour effectuer une variété d’analyses secondaires ou créer des figures de qualité publication à partir de fichiers/objets QIIME 2 (par exemple, un graphique à barres taxonomique ou un graphique de raréfaction alpha).
Analyse de la diversité
Nous avons utilisé la commande QIIME 2 « qiime diversity core-metrics-phylogenetic » pour calculer les métriques de diversité alpha et bêta de nos échantillons. Lors de l’exécution de la commande, pour normaliser la différence de profondeur de lecture entre les échantillons, nous avons utilisé l’option “-p-sampling-depth” pour raréfier nos échantillons à 5 000 lectures de séquence et avoir une profondeur de couverture égale. Nous nous sommes également assurés que tous les échantillons étaient séquencés à une profondeur de couverture suffisante pour l’analyse de la diversité en créant des courbes de raréfaction (Fig. S10 supplémentaire). De plus, nous avons utilisé l’option “-i-phylogeny” pour fournir un arbre phylogénétique enraciné des ASV observés, qui est nécessaire pour effectuer la PCoA en fonction de la distance UniFrac pondérée.38.
analyses statistiques
Pour évaluer l’abondance différentielle du microbiome dans le contexte d’informations cliniques telles que la naissance prématurée, nous avons utilisé la commande QIIME 2 “qiime composition ancom” pour effectuer ANCOM, qui compare le log-ratio centré (CLR) de l’abondance relative entre deux ou plusieurs groupes d’échantillons39. Pour déterminer si des groupes d’échantillons sont significativement différents les uns des autres en diversité bêta, nous avons effectué PERMANOVA en utilisant la commande QIIME 2 “qiime diversity adonis” qui adapte les hypothèses du modèle linéaire à une matrice de distance (par exemple, UniFrac pondéré) avec les variables choisies. Nous avons effectué des tests d’hypothèse d’amorçage en construisant un intervalle de confiance à 95 % avec la méthode “scipy.stats.t.interval” dans le package scipy pour comparer les similitudes dans la composition du microbiome entre les jumeaux et des échantillons choisis au hasard.40.
