Innocuité et immunogénicité du vaccin inactivé contre la fièvre de la vallée du Rift Smithburn chez le mouton | Journal de virologie

Cellules et virus

Les lignées cellulaires adhérentes de rein de bébé hamster (BHK-21) et de rein de singe vert d’Afrique (Vero), fournies par la Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées (ECACC, Royaume-Uni), ont été maintenues à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Les cellules ont été cultivées en utilisant des techniques de culture cellulaire standard dans du Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) (Gibco, USA) complété avec 10 % (v/v) de sérum bovin (Cell Sera, Australie) et des antibiotiques (100 000 U/L de pénicilline (Sigma Aldrich). , USA), 100 mg/L de streptomycine (Sigma Aldrich, USA) et 5,3 mg/ml d’amphotéricine B (Sigma Aldrich, USA).

La souche du virus RVF Smithburn utilisée dans la production du vaccin fabriqué par Onderstepoort Biological Products SOC Ltd a été obtenue selon des procédures internes. La souche vaccinale contre la FVR s’est propagée dans les cellules BHK-21 sur 850 cm² flacons roulants. Le virus a été quantifié par des tests de plages virales sur des monocouches de cellules Vero et les résultats ont été exprimés sous forme de log_dix UFP/ml [11].

Production et inactivation du RVFV Smithburn

Le RVFV Smithburn vivant atténué a été produit dans du BHK-21 à 37 ° C sur un appareil roulant et surveillé quotidiennement jusqu’à ce que (2 à 3 jours) un effet cytopathique de 90% soit atteint. Le RVFV infectieux Smithburn a été quantifié par test d’unités formant plaques (PFU) sur culture de cellules Vero [24].

L’éthylèneimine binaire (BEI) a été sélectionnée comme agent inactivant et préparée selon la méthode décrite par Bahnemann [25]. La culture RVFV a été utilisée à un titre minimum de 1,00E + 06 PFU/mL et les concentrations finales suivantes de BEI ont été évaluées pour l’inactivation de la souche Smithburn : 0,5 mM, 1 mM, 1,5 mM et 2 mM. Après l’ajout de chaque concentration de BEI aux cultures de cellules entières RVFV Smithburn, celles-ci ont été incubées à 37 ° C sous agitation continue à 150 tr/min pendant 24 h. Chaque concentration de BEI a été préparée dans plus d’un flacon et évaluée à des intervalles de 2 heures. Le virus non traité a été inclus comme contrôle. La réaction d’inactivation du virus BEI a été immédiatement neutralisée en ajoutant du thiosulfate de sodium pentahydraté 1 M (H_dixDéjà₂Ô₈S₂) aux aliquotes échantillonnées à la concentration finale de 10 % du volume de BEI ajouté. Les échantillons inactivés neutralisés ont été conservés à 4 ° C jusqu’à ce qu’ils soient testés pour l’infectiosité du RVFV sur culture cellulaire. L’inactivation a été réalisée dans trois expériences indépendantes.

L’inactivation du virus a été validée à l’aide du système RTCA (Real-Time Cell Analysis) (xCELLigence™, DP ACEA Biosciences Inc, US) dans le cadre de l’assurance qualité. [26]. La suspension cellulaire Vero à 1–5 × 10⁴ cellules/mL ont été ensemencées sur les plaques RTCA à 16 puits et 100 µL du milieu de culture additionné de 10 % de sérum ont été ajoutés pour constituer un volume de 200 µL. La croissance cellulaire a été surveillée en enregistrant l’indice cellulaire (IC) toutes les heures pendant 48 h maximum afin d’obtenir une croissance cellulaire exponentielle avant l’infection avec les aliquotes inactivées de RVFV Smithburn. Les plaques à 16 puits ont été incubées pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO₂ après infection avec des aliquotes de 100 µL de RVFV inactivé. Un milieu de culture cellulaire a été ajouté et les plaques ont été incubées à 37 ° C avec 5 % de CO₂ et surveillé sur le système RTCA jusqu’à 100 h. La culture cellulaire Vero, non traitée avec le virus, a été incluse comme contrôle dans l’analyse.

Production de vaccins inactivés RVFV Smithburn

Le vaccin RVFV Smithburn a été préparé sur des cellules BHK-21 et la culture virale récoltée a été inactivée à la concentration prédéterminée de BEI. L’inactivation complète du virus a été confirmée et validée en infectant une monocouche de culture cellulaire Vero avec le virus Smithburn tué sur des microplaques à 96 puits et des plaques E RTCA à 16 puits. Deux émulsions vaccinales ont été formulées à partir des cultures RVFV Smithburn inactivées, l’une avec un gel d’hydroxyde d’aluminium et l’autre avec les adjuvants Montanide™ Gel 01 PR (SEPPIC, France). Les formulations vaccinales ont été préparées dans des conditions stériles à température ambiante en utilisant un homogénéisateur à grande vitesse, D500 (Wiggens, Chine) à 13 000 tr/min. Les deux formulations vaccinales ont été soumises à des tests de contrôle de qualité standard avant utilisation.

Animaux, logement et soins

Vingt moutons mérinos de sexe mixte et âgés de 6 à 12 mois proviennent de la ferme Langfontein à Mpumalanga, en Afrique du Sud. Les animaux ont été présélectionnés pour détecter la présence d’anticorps contre le RVFV à l’aide de tests sérologiques avant le début de l’essai. Le test de neutralisation du sérum (SNT) a été réalisé en interne à l’OBP et les échantillons ont été envoyés au Conseil de la recherche agricole de l’Institut vétérinaire d’Onderstepoort pour un test immuno-enzymatique (ELISA). [27, 28]. Les animaux exempts d’anticorps contre le RVFV ont été livrés à l’OBP pour des études de sécurité et d’immunogénicité des vaccins. Les moutons étaient hébergés dans des écuries offrant des conditions environnementales contrôlées à température ambiante (20-25 °C) et des lumières éteintes la nuit pour imiter l’environnement naturel. Les animaux ont ensuite été autorisés à s’acclimater pendant 7 jours avant l’essai. Les températures rectales des animaux ont été enregistrées quotidiennement à partir des 4 jours précédant le début de l’essai. Les animaux ont été nourris avec des granulés d’Epol Ram, d’agneau et de brebis, d’Eragrostis et ont eu accès à l’eau. à volonté. Les écuries étaient nettoyées quotidiennement et les copeaux de bois recouvrant le sol étaient remplacés une fois par semaine. Les animaux inscrits à l’étude ont été identifiés par des étiquettes auriculaires situées à droite. La manipulation des animaux a été effectuée conformément aux procédures opérationnelles standard du département des animaux expérimentaux de l’OBP.

Innocuité et immunogénicité des vaccins inactivés RVFV Smithburn chez le mouton

Les animaux ont été répartis en quatre groupes (A, B, C et D), chaque groupe contenant 5 moutons pour les études de sécurité et d’immunogénicité. Les groupes A et B ont été attribués respectivement aux vaccinations contre le RVFV à l’hydroxyde d’aluminium et à l’adjuvant Montanide Gel-01. Les animaux individuels ont été vaccinés par voie sous-cutanée (SC) sur l’intérieur de la cuisse gauche avec 1 ml de vaccins inactivés avec adjuvant contre le RVFV aux jours 0 et 28 (Tableau 2). Les animaux des groupes C et D devaient être vaccinés respectivement avec le vaccin commercial inactivé contre le RVFV fourni par OBP et avec un diluant stérile pour vaccin, servant ainsi de contrôles positif et négatif. L’état de santé clinique général de chaque animal, y compris les symptômes du RVFV (tels que fièvre, écoulement nasal, perte d’appétit, faiblesse et diarrhée sanglante) ont été surveillés et enregistrés une fois par jour pendant toute la durée de l’étude. Les températures corporelles rectales des animaux ont été enregistrées au moins une fois par jour pendant 21 jours après chaque vaccination.

Collecte de sang

Chaque mouton participant à cette étude a été saigné dans 4 à 5 ml d’activateur de caillot et de gel séparant des tubes à bouchon jaune aux jours 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 et 63 pour l’analyse sérologique de la réponse immunitaire humorale. Le sang collecté a été centrifugé à 2500×g à 4 °C pendant une heure. Les échantillons de sérum ont été récoltés dans des flacons cryogéniques stériles et chauffés à 56 ° C dans un bain-marie pendant 30 minutes pour inactiver les substances inhibitrices virales non spécifiques. Les échantillons de sérum inactivés par la chaleur ont été conservés à – 20 ° C jusqu’à leur utilisation pour l’analyse sérologique.

Évaluation de la réponse immunitaire en anticorps par test immuno-enzymatique (ELISA)

Les taux d’anticorps IgM et IgG induits chez le mouton contre le RVFV ont été estimés à l’aide du test ELISA, basé sur la nucléoprotéine recombinante (protéine N). L’ELISA a été réalisé à l’ARC-OVI pour la détection simultanée des anticorps IgM et IgG contre le RVFV. La procédure a été réalisée selon la méthode décrite par Ellis et al. [27]. L’absorbance nette lue à OD_(450 nm) a été exprimé en % S/P du contrôle positif, et tous les échantillons de sérum avec un % S/P ≥ 7 ont été considérés comme positifs [27].

Évaluation de la réponse immunitaire anticorps par test de neutralisation sérique (SNT)

Le test SNT a été utilisé pour détecter la présence d’anticorps neutralisants spécifiques dans le sérum de moutons vaccinés. Les niveaux d’anticorps mesurés par ce test sont principalement induits contre les glycoprotéines Gn/Gc du RVFV et confèrent une protection aux animaux infectés et vaccinés. La méthode SNT a été réalisée comme décrit par Frey et Liess [28]. En bref, les échantillons de sérum inactivés par la chaleur ont été dilués en série deux fois en utilisant un milieu de culture cellulaire GMEM complété par des antibiotiques streptomycine et amphotéricine B (Sigma Aldrich, USA). Des sérums anti-RVFV positifs et négatifs ont été inclus comme contrôles. Le RVFV Smithburn vivant a été ajouté dans chaque puits (50 µL) pour atteindre une concentration finale de 100 TCID.₅₀/ml. Après une heure d’incubation des sérums avec le virus à 37 ° C, 100 µL de cellules Vero ont été ajoutés dans des plaques de microtitrage à 96 puits. La monocouche cellulaire a été examinée pour détecter la présence de CPE au microscope optique après quatre jours. Les titres d’anticorps ont été exprimés comme l’inverse de la dilution sérique qui a inhibé 50 % du CPE induit par le virus. [29].

Approbation éthique

L’expérience d’essai clinique vétérinaire a été réalisée conformément au protocole approuvé par le Comité d’éthique animale de l’OBP (numéro d’enregistrement du Conseil vétérinaire sud-africain : FR1514054) sous le numéro d’approbation OBP2019/002 et par le ministère de l’Agriculture, de la Réforme agraire et du Développement rural en vertu de la section 20 de la Loi sur les animaux. Loi sur les maladies (loi 35 de 1984) ; numéro d’homologation 12/11/1/1/(b) MG.

analyses statistiques

Une analyse statistique a été réalisée pour comparer la différence significative de la réponse immunitaire en anticorps induite chez le mouton par les formulations inactivées du RVFV Smithburn. Une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA) suivie d’un test de Tukey post hoc a été utilisée pour déterminer la différence de réponse immunitaire en anticorps au fil du temps. Le logiciel Graphpad prism version 5.0 pour Windows a été utilisé pour l’analyse statistique à un niveau de signification de 5 % (p< 0,05).