Dans une étude récente publiée dans Celluledes chercheurs ont signalé la circulation d’un nouveau coronavirus (CoV) de type syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) parmi les pangolins malais, Javanica douce CoV associé à HKU4 (MjHKU4r-CoV).
Arrière-plan
L’origine zoonotique et la transmission des CoV provoquant des épidémies chez l’homme, comme le MERS, le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), ne sont pas bien caractérisées. Les chauves-souris abritent plusieurs coronavirus du Merbecovirus et sous-genre Sarbecovirus, et MERS-CoV, SARS-CoV-1 et -2 proviendraient de chauves-souris.
Cependant, les CoV de chauve-souris ont généralement besoin d’adaptations supplémentaires avant d’infecter et de se répliquer dans les cellules hôtes, ce qui indique le besoin d’hôtes animaux intermédiaires. Des efforts de surveillance et de recherche continus sont nécessaires pour approfondir la compréhension des pangolins en tant qu’hôtes sensibles ou réservoirs de CoV associés aux chauves-souris et améliorer la préparation à l’émergence probable de CoV de type MERS chez les pangolins.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont exploré les pangolins en tant que réservoirs ou espèces hôtes sensibles pour la transmission zoonotique du CoV des chauves-souris.
Des échantillons d’écouvillons de la région anale (n = 86) de pangolins malais, introduits illégalement des régions du sud-est de l’Asie en Chine, ont été soumis à une réaction en chaîne par polymérase (PCR) quantitative et en temps réel pan-CoV avec l’acide ribonucléique (ARN) dépendant Gène de l’ARN polymérase (RdRp) comme cible.
Par la suite, un séquençage de nouvelle génération, une analyse métagénomique, un séquençage de Sanger, une amplification rapide des extrémités d’acide désoxyribonucléique complémentaires (RACE), une analyse phylogénétique, un Western blot et des analyses recombinantes ont été effectués. Des expériences d’interférométrie de biocouche, de production d’interféron-I (IFN-I) et des dosages de rapporteur de luciférase de signalisation, des dosages antiviraux et des dosages de neutralisation virale par réduction de fluorescence ont été réalisés.
Pour étudier la prévalence du MjHKU4r-CoV chez les pangolins, des tests du système d’immunoprécipitation à la luciférase (LIPS) à base de protéine MjHKU4-CoV-1 ont été effectués. En outre, les particules virales ont été examinées par microscopie électronique à transmission et une analyse par immunofluorescence a été réalisée à l’aide de cellules d’adénocarcinome colorectal humain (cellules Caco-2) pour la coloration NP.
L’équipe a étudié si MjHKU4r-CoV-1 utilisait la dipeptidyl peptidase-4 humaine (hDPP4) pour l’entrée cellulaire en inoculant des lignées cellulaires d’hépatome humain (Huh-7) avec et sans DPP4 avec MjHKU4r-CoV-1. L’équipe a évalué si des mutations ponctuelles dans la région estimée de clivage de la furine réduiraient le clivage de la protéine de pointe protéolytique (S) et l’infection virale.
De plus, l’équipe a recherché si le clivage de la protéase était spécifique à la furine et si le MjHKU4r-CoV-1 pouvait infecter les chauves-souris et les humains. La gamme d’hôtes probable du virus a été déterminée. L’infection par le MjHKU4r-CoV-1 a été évaluée dans plusieurs lignées cellulaires humaines, organes et ex vivo organoïdes. En outre, en direct des analyses ont été effectuées sur des souris transgéniques hDPP4 provoquées par voie intranasale avec MjHKU4r-CoV-1 pour évaluer la pathogénicité de MjHKU4r-CoV-1. Les antagonistes de l’interféron à code viral et l’efficacité thérapeutique des agents de traitement connus contre le MjHKU4r-CoV-1 ont été déterminés.
Résultats
Un nouveau coronavirus de type MERS (Merbecovirus) MjHKU4r-CoV, phylogénétiquement associé au HKU4-CoV de chauve-souris, a été identifié parmi les pangolins malais. Les cellules Caco-2 du virus MjHKU4r-CoV-1 isolées utilisaient hDPP4 et des protéases cellulaires pour l’entrée dans les cellules, et la liaison était renforcée par un site de clivage de la furine (très probablement RQQR) absent des HKU4r-CoV de chauve-souris connus. MjHKU4r-CoV-1 avait une gamme d’hôtes plus large, élargie par la furine, par rapport au HKU4-CoV des chauves-souris, et était infectieux et pathogène parmi les animaux murins transgéniques et les organoïdes intestinaux et respiratoires des humains.
Sur 86 animaux, quatre étaient séropositifs par PCR pan-CoV, et sept échantillons de sérum ont montré une séropositivité au MjHKU4r-CoV dans les tests LIPS (11 % et 13 %). Quatre séquences génomiques presque identiques ont été obtenues à partir d’échantillons de Javanica douce CoV 1 à 4 associé à HKU4 (MjHKU4r-CoV-1–4). MjHKU4r-CoV-1 partageait respectivement 87 % et 68 % d’identité génétique avec HKU4-CoV et MERS-CoV. MjHKU4r-CoV-1 a montré la plus grande similitude nucléotidique avec le HKU4-CoV des chauves-souris.
Aucun événement de recombinaison n’a été observé dans les séquences génomiques de MjHKU4r-CoV-1. MjHKU4r-CoV-1 s’est avéré appartenir à la Tylonycteris chauve-souris CoV HKU4 Espèces de Merbecovirus sous-genre. Les particules virales ont montré la morphologie habituelle du CoV et un diamètre de 100,0 nm. L’infection par MjHKU4r-CoV-1 a été considérablement atténuée dans les cellules d’hépatome humain prétraitées avec E64D, un inhibiteur de protéase de la classe des cystéines. L’enzyme trypsine n’était pas nécessaire pour l’infection virale, ce qui indique que MjHKU4r-CoV-1 s’est entièrement adapté au clivage de type protéolytique parmi les cellules humaines.
L’équipe a observé le clivage protéolytique pour MERS-CoV et les protéines de pointe MjHKU4r-CoV-1 de type sauvage, mais pas pour les protéines mutées de HKU4-CoV et MjHKU4r-CoV-1. Une protéase hôte a clivé la protéine de pointe MjHKU4r-CoV-1 pendant la synthèse, et le clivage était essentiel pour l’entrée cellulaire. L’infection par MjHKU4r-CoV-1 a été médiée par des orthologues de la protéine DPP4 provenant de chèvres, de porcs, de lapins, de chats, de moutons, de macaques, de chameaux, de bovins et de ouistitis, mais pas de chevaux, de furets, de hamsters, de rats, de souris et de chiens. Le MjHKU4r-CoV-1 a effectivement proliféré dans les cellules humaines A549, Caco-2, Calu-3, Huh-7 et les cellules rénales embryonnaires humaines 293 (HEK293), indiquant un large tropisme viral.
L’infection par MjHKU4r-CoV-1 a entraîné des réponses retardées à l’interféron dans les lignées cellulaires Caco-2, indiquant que la réponse à l’interféron hôte (IFN) a été éludée par le virus. Spike, membrane (M), cadre de lecture ouvert (ORF) -3 et 04a ont inhibé de manière significative l’activation du promoteur IFN-β, tandis que M, NP, ORF-3, -4a et -4b et -8b ont inhibé de manière significative l’activité de promoteur de l’élément de réponse stimulé par l’interféron de type I (ISRE). Remdesivir, EIDD-2801 et C376 ont montré des effets anti-MjHKU4r-CoV-1, supprimant l’infection par MERS-CoV et MjHKU4r-CoV-1 dans une mesure similaire.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont mis en évidence un nouveau CoV de type MERS circulant parmi les animaux pangolins malais et ont montré que les pangolins sont des réservoirs de coronavirus susceptibles d’affecter les humains.
