Le développement d’un immunocapteur électrochimique utilisant un anticorps anti-spike IgY de poulet pour la détection du SRAS-CoV-2

Dans cette section, nous décrirons les méthodes et le matériel utilisés dans ce travail.

Hébergement de poulet pour expérience

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’université de Yarmouk (No.AICUC/2021/11) conformément aux directives de l’Institut national jordanien et américain de la santé. Toutes les études impliquant des animaux. L’étude de ce travail est rapportée conformément aux directives ARRIVE.

Deux pièces de l’animalerie de l’Université de Yarmouk ont ​​été reconstruites pour accueillir les poules pondeuses Novogen White (Longhorn) âgées de 22 semaines. Après désinfection de la zone, de la paille a été étalée sur le sol et une mangeoire, des boissons et des seaux propres ont été utilisés. La lumière a été programmée de manière à ce qu’elle soit allumée pendant 18 heures et éteinte pendant 6 heures, et la température de la pièce a été maintenue à 26 °C. Des poules en bonne santé ont été achetées dans une ferme locale. La ponte des œufs a été observée pour chaque poule, collectée quotidiennement et conservée au réfrigérateur jusqu’à utilisation.

Immunisation des poulets et production d’IgY anti-S

Les poulets (3 par groupe) ont été immunisés par voie intramusculaire dans la poitrine avec des antigènes purs de protéines (S) du SRAS-CoV-2 contenant 400 µg mélangés dans un rapport 1:1 avec de l’adjuvant de Freund complet ou incomplet (CFA) (Thermo Fisher, USA) selon une norme protocole de vaccination. La première injection a été préparée avec FCA et trois injections avec FIA ont été administrées à 2 semaines d’intervalle. Le groupe témoin a reçu une injection de solution saline normale mélangée à un adjuvant correspondant. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des poulets immunisés et témoins dans des tubes Vacutainer simples (FL Medical, Italie) et laissés coaguler. Le sérum a été collecté après centrifugation des tubes à 2000 ×g (MPW-251, Pologne) pendant 10 min.

Évaluation des IgY anti S par ELISA

Les activités de liaison des anticorps ont été testées par ELISA. En bref, une plaque à 96 puits (Greiner Bio-One, Allemagne) a été recouverte de 5 µg/mL d’antigènes S recombinants (RayBiotech, USA) préparés dans un tampon carbonate-bicarbonate (0,05 M, pH 9,6) (PS Park, Royaume-Uni). Des anti-anticorps purifiés avec différentes dilutions ont été utilisés pour déterminer le titre en anticorps. Enfin, un anti-IgY de lapin conjugué à la HRP (abcam, Royaume-Uni) dilué au 1: 1000 a été ajouté comme traceur. La densité optique a été mesurée après l’ajout d’une solution de substrat (TMB, Sigma-Aldrich, Allemagne) à 450 nm à l’aide du spectrophotomètre à microplaques Multiskan ™ GO (Thermo Fisher, USA).

Extraction d’IgY de poulet à partir du jaune d’oeuf

Les IgY de poulet ont été préparées en utilisant la technique PEG. En bref, le jaune d’œuf sans blanc a été collecté dans des tubes de 50 ml et mélangé avec deux volumes de PBS (Vivantis, Malaisie) et 3,5 % de polyéthylène glycol (PEG) 6000 (Bio basic, Canada), puis vortexé au vortex (Velp Scientifica, Italie). , suivi d’un roulage de 30 min sur un malaxeur à rouler (BIOBASE, Chine). La phase aqueuse a été transférée dans un nouveau tube et du PEG 6000 à 9,5 % a été ajouté, puis vortexé et roulé pendant 15 min. L’étape de centrifugation a été répétée et le culot contenant l’IgY précipitée a été collecté et dissous à nouveau dans du PEG 6000 à 12 % et traité comme précédemment. Après centrifugation, le culot est dissous dans du PBS et dialysé pendant une nuit avec 1 L de PBS en utilisant une membrane de cellulose (Sigma-Aldrich, Allemagne). La teneur en protéines (mg/mL) des échantillons dialysés a été mesurée par le test de protéines de Bradford (Sigma-Aldrich, USA) et les échantillons ont été conservés à -20 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure.

Purification d’anticorps polyclonaux de poulet à l’aide d’une colonne HiTrap IgY

La colonne de purification HiTrap IgY (Cytiva, Suède) est une colonne préemballée et prête à l’emploi pour la purification des IgY du jaune d’œuf. En bref, la colonne a été chargée avec 5 ml d’extrait brut de PEG d’œuf dilué dans un tampon de liaison après avoir été lavée avec un tampon de liaison 5 × (phosphate de sodium 20 mM, 0,5 MK₂DONC₄, pH 7,5). La colonne a été lavée avec un tampon de liaison 10 x jusqu’à ce qu’aucune matière n’apparaisse dans l’effluent. Les IgY de poulet ont été éluées en utilisant un tampon d’élution (phosphate de sodium 20 mM, pH 7,5). L’éluant a été concentré par un concentrateur Vivispin avec un MWCO de 30 kDa (Merck Millipore, USA). Les anticorps ont été lavés deux fois avec du PBS, pH 7, 4 et stockés à – 20 ° C pour un traitement ultérieur.

Caractérisation des IgY de poulet purifiées par SDS-PAGE

SDS-PAGE a été réalisée pour l’évaluation de la pureté des IgY. (19: 1) Une solution d’acrylamide / bisacrylamide à 40% (Fisher Biotech, USA) a été utilisée. Cela a été réalisé en utilisant un minigel Desaphor VE (Cleaver scientific, Royaume-Uni) dans le système tampon discontinu en utilisant des gels d’acrylamide-bisacrylamide à 12 % d’épaisseur de 0,5 mm dans des conditions réductrices. Dix microlitres d’extrait d’œuf ou d’IgY purifiées ont été mélangés avec un volume égal de tampon d’échantillon (pH 6,8) et chargés sur gel après avoir été bouillis pendant 5 minutes. Pour la détermination de la taille des bandes, un étalon de protéine précoloré de poids moléculaire (Bio-helix, New Taipei City, Taiwan) a été utilisé après avoir été traité de la même manière que les échantillons d’extrait. L’électrophorèse a été réalisée en utilisant un tampon de pH 8, 3 à 120 V pendant 60 à 120 min. Le gel a été coloré avec du bleu brillant de Coomassie R-250 (piscine BDH, Dorset, Royaume-Uni) et décoloré avec de l’acide acétique à 20 % (LOBA Chemie, Inde) jusqu’à l’apparition de bandes claires.

Identification de la réactivité anticorps-protéine par Western blot

La réactivité des IgY antigène S a été déterminée par western blot. Les antigènes recombinants du SRAS-CoV2 ont été soumis à une électrophorèse dans un gel SDS-PAGE à 12 %, transférés dans la membrane de nitrocellulose et bloqués avec de l’albumine sérique bovine à 3 %. La membrane a été incubée avec des IgY de poulet purifiées et incubée pendant 1 h à température ambiante. Sur une bascule à plaque. Après le lavage de la membrane, des IgY monoclonales de souris anti-poulet (H&L) HRP conjuguées (MY BioSource, USA) diluées au 1: 1 000 dans du PBS-Tween ont été ajoutées et incubées pendant 1 h à température ambiante. Le substrat TMB prêt à l’emploi a été coulé sur des bandes lavées jusqu’à développement de la couleur.

Fabrication de capteurs

Dans toutes les expériences, un capteur d’or à trois électrodes (fabriqué par BVT Technologies, République tchèque) a été systématiquement utilisé. Il se compose d’une contre-électrode (CE) et d’une électrode de travail (WE), toutes deux en or, et d’une électrode de référence argent/chlorure d’argent (RE), comme illustré sur la figure 1. La préparation du biocapteur impliquait plusieurs étapes. Initialement, la surface de l’électrode a été rincée avec de l’eau déminéralisée et laissée sécher à température ambiante (RT). Après le processus de nettoyage, la fabrication s’est déroulée en ajoutant 3 µL de cystéamine 2 mM (Sigma-Aldrich, Allemagne) exclusivement à l’électrode de travail. Cette étape visait à chimisorber les sites thiols de la cystéamine à la surface des nanoparticules d’or. Par la suite, une couche de 30 µL de glutaraldéhyde 5 mM (Alfa Aesar, Allemagne) a été appliquée sur l’électrode pour créer une liaison entre les groupes cystéamine et glutaraldéhyde. Ceci a été suivi par l’ajout de 30 µL de 5 µg d’anticorps IgY anti-spike protéine, qui a lié les groupes amine de l’anticorps aux groupes aldéhyde du glutaraldéhyde. Ensuite, 30 µL d’éthanolamine 5 mM (Sigma-Aldrich, Allemagne) ont été appliqués à l’électrode pour éviter les espaces non liés. Toutes ces étapes de préparation impliquaient une incubation de 10 minutes à température ambiante (23 °C) contrôlée à l’aide du climatiseur ambiant.

Procédure de mesure

Pour détecter la protéine de pointe, la surface des électrodes a été préparée pour créer le biocapteur avant chaque expérience. Le biocapteur a été recouvert de 30 µL de protéine Spike (S) du SRAS-CoV-2 (740, 370, 185, 92,5, 46,25, 23,125 et 11,56 ng/mL) et incubé pendant 15 minutes à température ambiante. Avant d’effectuer des mesures électrochimiques, les biocapteurs ont été nettoyés avec de l’eau déminéralisée, rincés avec 1 ml de PBS, puis séchés à température ambiante.

Dans toutes les expériences, la voltamétrie cyclique (CV) et la spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) ont été réalisées à l’aide d’un potentiostat portable polyvalent (PalmSens4 BV, v5.9, Pays-Bas). Les mesures ont été effectuées en utilisant du PBS contenant 5 mM de ferri/ferrocyanure de potassium. [Fe(CN)₆]³⁻/[Fe(CN)₆]⁴⁻ (Thermo Fisher, États-Unis). Tous les CV ont été réalisés dans une plage de tension de -0,2 à 0,5 V avec un pas de potentiel de 0,01 V et une vitesse de balayage de 0,1 V/s. Dans les mesures EIS, la plage de fréquences était de 100 kHz à 0,5 Hz et les tensions alternative et continue étaient respectivement de 0,005 V et 0,0 V.

Pour identifier la protéine de pointe, le signal électrochimique du capteur personnalisé est enregistré après avoir effectué une étape de blocage à l’aide d’éthanolamine, qui sert de signal de fond. Ensuite, le capteur est exposé à l’analyte pour incubation et le signal électrochimique est à nouveau mesuré. À mesure que la concentration de l’analyte augmente, les résultats obtenus par voltamétrie cyclique démontrent une diminution du courant de pointe au potentiel d’activation. De plus, la spectroscopie d’impédance révèle une augmentation de l’impédance avec l’augmentation de la concentration en analyte. Enfin, pour obtenir le signal d’analyte précis, le signal de fond est soustrait de chaque signal d’analyte mesuré.

L’immunocapteur anti-S a ensuite été évalué pour déterminer la limite de détection (LOD) par dilution allant de 180 pg/mL à 2,83 pg/mL d’antigène S recombinant du SRAS-CoV2. Pour valider l’efficacité des biocapteurs de protéines anti-spike, des échantillons nasopharyngés aléatoires positifs au COVID-19 ont été examinés après avoir été prélevés à la pipette à partir de la solution de lyse incluse dans le test RAPID (ATLAS Biomedical, Jordanie) et dilués dans du PBS à des dilutions variables. Les échantillons ont été collectés par un personnel qualifié dans une clinique chargée d’effectuer le test d’antigène RAPID SARS-CoV-2 par le ministère de la Santé jordanien. Des flacons contenant les tampons d’échantillon sur lesquels les écouvillons nasopharyngés ont été lavés ont été utilisés dans cette étude.