La nouvelle méthode « CLEVER » accélère l’ingénierie et l’étude génétique du SRAS-CoV-2 et de ses variantes

Une étude récente publiée sur bioRxiv* Le serveur de préimpression a décrit la mutagenèse rapide et le sauvetage des variantes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) sans clonage, en utilisant une nouvelle stratégie de génétique inverse.

Étude: Mutagenèse rapide sans clonage de nouvelles variantes du SRAS-CoV-2 à l’aide d’une nouvelle plateforme de génétique inverse. Crédit d’image : kentoh/Shutterstock.com

*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.

Arrière-plan

Les méthodes de génétique inverse établies pour les CoV ont été adaptées au SRAS-CoV-2 après son émergence. Une méthode basée sur l’ADN, les amplicons sous-génomiques infectieux (ISA), permet la recombinaison de fragments d’ADN transfectés se chevauchant dans un génome de pleine longueur, qui a été récemment adapté au SARS-CoV-2.

L’étude et les conclusions

Dans la présente étude, les chercheurs ont développé et décrit une stratégie basée sur l’ISA appelée «système sans clonage et échangeable pour l’ingénierie et le sauvetage des virus» (CLEVER), utilisant le SRAS-CoV-2.

Huit fragments génomiques SARS-CoV-2 se chevauchant ont été amplifiés et transfectés dans des cellules HEK293T. La propagation résultante du virus recombinant (rCOV2) a été évaluée en observant l’effet cytopathique (CPE).

L’équipe a observé le premier CPE cinq à huit jours après la transfection (DPT). Ils n’ont observé aucune amélioration de la récupération du virus avec la co-transfection de plasmide exprimant des nucléotides ou d’ARN messager (ARNm). De plus, à titre d’optimisation, les fragments ont été réduits de huit à quatre.

Une cellule productrice de virus pour 11 000 cellules a été observée en transfectant quatre fragments, contre une sur 160 000 cellules pour la transfection à huit fragments.

De plus, l’équipe a testé l’impact de la transfection à l’aide de quatre fragments sur la fidélité de la reconstitution en comparant la compétence de réplication entre les isolats de type sauvage et les virus recombinants. La taille et la forme du virus de type sauvage et du rCOV2 généré à partir de quatre fragments (rCOV2-4fr) étaient similaires.

Bien que la cinétique de réplication du rCOV2-4fr ait révélé des titres réduits dans les 24 heures suivant l’infection, les titres étaient comparables après une infection prolongée. La microscopie électronique à transmission a été utilisée pour comparer l’intégrité des virions. Le rCOV2-4fr était indiscernable du virus de type sauvage.

L’équipe a indiqué que le processus de reconstitution était reproductible, avec une récupération réussie du virus à partir des lignées cellulaires HEK293, HEK293T, BHK-21 et CHO.

Ensuite, l’équipe a optimisé le processus d’amplification en adoptant certaines règles, telles que l’utilisation d’une entrée de matrice élevée ou d’une polymérase haute fidélité, la limitation des cycles d’amplification à 25 et la mise en commun de huit réactions d’amplification parallèles.

Les chercheurs ont introduit un site de marqueur génétique (reconnaissance Sal I) pour différencier les virus recombinants de la contamination accidentelle par des isolats cliniques. Ce marqueur était présent dans tous les virus reconstitués.

De plus, l’équipe a introduit la séquence du gène de pointe des variants du SRAS-CoV-2 tout en conservant/conservant la séquence de la souche ancestrale restante (Wuhan) comme arrière-plan.

La séquence cible (variant spike gene) a été amplifiée à l’aide de plasmides commerciaux ou maison. Les particules virales chimériques ont été récupérées et confirmées par séquençage.

Des virus chimériques récupérés ou des isolats cliniques de la souche Wuhan et des variants Omicron BA.1 ou BA.5 ont été soumis à des échantillons de sérum d’individus vaccinés. Les titres de neutralisation les plus élevés étaient contre la souche Wuhan. Les titres étaient similaires entre les virus chimériques et leurs homologues de pointe respectifs.

L’étape d’amplification pourrait être exploitée pour la mutagenèse sans encore synthèse ou clonage. L’équipe a conçu une paire d’oligonucléotides qui a introduit N501Y ou G614D. Les fragments hébergeant ces mutations ponctuelles ont été co-transfectés avec d’autres fragments nécessaires à l’assemblage du génome.

Le séquençage a confirmé l’introduction réussie des substitutions. En outre, ils ont conçu des amorces oligonucléotidiques pour supprimer ORF3a, ce qui a été confirmé par séquençage et immunotransfert.

En outre, l’équipe a introduit avec succès une séquence étrangère spécifique au site (étiquette triple FLAG) près de l’extrémité carboxy de l’ORF8. De plus, les chercheurs ont légèrement modifié la stratégie pour sauver directement le rCOV2 des isolats cliniques.

Ils ont cloné des éléments d’expression eucaryotes requis pour la transcription dépendante de l’ADN du génome viral ou des plasmides personnalisés obtenus dans le commerce codant pour ces éléments. Tous les éléments ont été assemblés en un seul ADN de liaison.

Cent paires de bases de régions non traduites (UTR) virales 3′ et 5′ flanquaient le fragment de liaison de chaque côté. Il a été conçu pour une recombinaison réussie en un produit d’ADN circulaire. Huit fragments génomiques du SARS-CoV-2 ont été amplifiés en une seule étape à partir de l’ARN viral. Les amplicons ont été co-transfectés avec le fragment de liaison. Des virus viables ont été récupérés sur sept DPT.

Cela a permis le sauvetage de différents virus chimériques sans clonage bactérien. Les génomes d’isolats cliniques de la souche SARS-CoV-2 Wuhan et des variants Omicron (BA.1 et BA.5) ont été amplifiés.

Le fragment contenant le gène de pointe a été échangé avec des fragments correspondants portant le(s) gène(s) de pointe variant(s). Par conséquent, des virus chimériques portant des gènes de pointe hétérologues ont été générés.

Enfin, l’équipe a sauvé un virus recombinant à partir d’un isolat clinique d’Omicron BA.5 comme décrit précédemment, mais avec des amorces introduisant la délétion ORF3a. De même, XBB.1.5 recombinant avec suppression ORF3a a été sauvé. Ainsi, les auteurs ont pu générer des mutants de délétion des variants émergents du SARS-CoV-2 en une seule étape.

conclusion

En résumé, l’approche CLEVER était très polyvalente avec une large application pour la mutagenèse rapide ou le sauvetage du SRAS-CoV-2 sans clonage. Les auteurs ont démontré la flexibilité de cette technique en introduisant des mutations ponctuelles, des séquences étrangères ou une délétion ORF3a.

De plus, par circularisation intracellulaire à l’aide du fragment de liaison, ils ont introduit la suppression ORF3a et sauvé des virus recombinants fonctionnels en une seule étape à partir de l’ARN viral.

*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.