Collecte d’échantillons
AGILE est une plateforme randomisée multi-bras, multi-doses, de phase I/IIa au Royaume-Uni utilisant une conception adaptative bayésienne transparente pour déterminer la sécurité, l’activité et la dose optimale de plusieurs candidats thérapeutiques SARS-CoV-2sept. Cet essai a évalué le molnupiravir (EIDD-2801/MK-4482), pour le traitement du COVID-19 dans un essai de phase I/II transparent (numéro d’enregistrement cliniquetrials.gov NCT04746183). En utilisant une méthode de bloc permuté (bloc de taille 2 ou 4) et en stratifiant par site, les participants ont été répartis au hasard (1:1) pour recevoir soit du molnupiravir plus le traitement standard, soit un placebo plus le traitement standard. La séquence de randomisation a été générée par l’utilisation de STATA (version 16) par un statisticien indépendant (qui n’a plus participé à l’essai) et utilisée pour préparer des packs de placebo et de traitement étiquetés, qui ont été attribués séquentiellement aux patients lors de la randomisation. Le placebo et le molnupiravir étaient fournis sous forme de comprimés d’aspect identique. Les participants éligibles étaient des hommes et des femmes âgés de ≥ 18 ans atteints d’une infection par le SRAS-CoV-2 confirmée par PCR qui étaient dans les cinq jours suivant l’apparition des symptômes, exempts de maladies chroniques non contrôlées et ambulants dans la communauté avec une maladie légère ou modérée. Tous les participants ont fourni un consentement écrit et éclairé avant l’inscription. Des écouvillons nasopharyngés ont été obtenus des participants les jours 1, 3, 5, 8, 11, 15, 22 et 29. Seuls les échantillons prélevés les jours 1, 3 et 5 ont été séquencés pour cette analyse. Le protocole complet de l’étude peut être trouvé dans les informations supplémentaires de l’article détaillant les résultats cliniques d’AGILE CST-29. Les informations sur les covariables des participants sont disponibles dans les données sources.
Extraction d’ARN, préparation de bibliothèques d’amplicons et séquençage Illumina
L’ARN a été extrait des écouvillons nasopharyngés par le laboratoire GCP de l’Université de Liverpool à l’aide d’un instrument Maxwell® RSC, un instrument automatisé d’extraction d’acide nucléique (Promega, États-Unis). Des aliquotes d’ARN excédentaires ont été fournies pour l’analyse de séquençage. Pour chaque participant, il y avait trois échantillons (des jours 1, 3 et 5), tous séquencés une fois. En bref, la préparation de la bibliothèque consistait à convertir l’ARN en ADNc à l’aide de LunaScript™ (Thermofisher, Waltham, Massachusetts), puis amplifié par amplification par complément inverse (RC)-PCR (EasySeq™ SARS-CoV-2 Whole Genome Sequencing Kit (V3) RC-COV096 , NimaGen, Nimègue, Pays-Bas)15. Ce kit code-barres et ligature les adaptateurs Illumina en une seule réaction PCR, avec deux pools séparés d’amorces (pools 1 et 2). Après amplification, les pools d’amorces 1 et 2 pour chaque échantillon amplifié ont été mélangés 1:1 avant d’être nettoyés avec des billes Beckman Coulter™ Agencourt AmpureXP (Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire), quantifiés et la qualité de la bibliothèque évaluée sur un bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent , Santa Clara, Californie). Tous les échantillons purifiés ont ensuite été regroupés et dénaturés. Enfin, la bibliothèque d’amplicons dénaturés a été chargée dans la cartouche NovaSeq (2 × 150 bp run) avant le chargement sur la machine NovaSeq 6000. Le séquençage a été effectué en deux séquences de séquençage distinctes, une pour les échantillons sur écouvillon des 120 premiers participants et une seconde pour les échantillons sur écouvillon des 60 derniers participants.
Traitement in silico
Les données de séquençage brutes ont été traitées à l’aide de deux pipelines différents (résumés dans la Fig. 5 supplémentaire). La première méthode, EasySeq_covid19 (version 0.9, code disponible sur https://github.com/JordyCoolen/easyseq_covid19), effectue des étapes de contrôle qualité, cartographie le génome de référence (Wuhan-Hu-1 ; NC045512.2), les appels variants et génèrent un génome consensus pour chaque échantillon15. Les paramètres par défaut ont été utilisés et sont les suivants : seuil d’appel de variante = 0,5 ; seuil de qualité d’appel variante = 20 ; variante appelant profondeur minimale = 10. Pangolin (version 4.0.6) a été utilisé pour attribuer la lignée SARS-CoV-2, avec une ambiguïté maximale fixée à 0,316. La deuxième méthode, DiversiTools (code disponible sur https://github.com/josephhughes/DiversiTools), utilise le fichier d’alignement primer-trimmed (nommé comme [sampleID]_L001.final.bam) et son fichier d’index associé (produit dans le pipeline EasySeq) ainsi que le génome de référence et un fichier de région codante pour analyser la variation génomique mineure et prédire la séquence d’acides aminés sur la base des données génomiques. DiversiTools permet une analyse approfondie de la diversité virale dans chaque échantillon, plutôt que simplement les informations génomiques consensuelles/dominantes, comme décrit précédemment17. Les participants ont été inclus dans l’analyse des variantes mineures si leurs trois échantillons répondaient aux critères suivants : 1) la séquence du génome dominant avait un consensus minimum de 90 % et 2) 90 % des positions du génome avaient une couverture minimale de 200X. La visualisation des données a été réalisée dans R (version 4.0.2), en utilisant le package tidyverse (version 1.3.2) pour la manipulation des données. Des tests de somme des rangs de Wilcoxon (bilatéraux) ont été utilisés pour déterminer les différences entre les groupes de traitement à chaque instant, rapportant la p-valeur ajustée (Bonferroni), en utilisant le package Rstatix (version 0.7.0). Toutes les parcelles ont été créées à l’aide de ggplot2 (version 3.3.6). Les chiffres ont été compilés à l’aide des packages cowplot (version 1.1.1) et magick (version 2.7.3). Les figures schématiques 1a, b et la figure supplémentaire 5 ont été créées à l’aide de Biorender.com.
Résumé des rapports
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.
