Une signature de trois gènes révèle des changements dans le microenvironnement immunitaire tumoral lors de la progression de la NAFLD au CHC

Criblage de gènes pronostiques liés à la NAFLD/NASH au CHC

Afin d’explorer les cibles clés régulant la transformation maligne des lésions hépatiques bénignes, nous avons essayé de trouver les gènes différentiels communs (DEG) dans la progression des lésions hépatiques bénignes et du CHC. Nous avons utilisé le package R “limma” pour filtrer 7668 DEG dans HCC à partir de la base de données TCGA, 458 et 8902 DEG dans NAFLD à partir de GSE89632 et GSE126848, et 2804 et 6396 DEG dans NASH à partir de GSE17470 et GSE126848, respectivement (changement de pli du journal > 1, p< 0,05) (Fig. 1A). Treize DEG ont été identifiés comme gènes clés régulant la transformation maligne NAFLD/NASH (Fig. 1B – D). Nous avons ensuite utilisé les données TCGA HCC pour effectuer une analyse de régression COX univariée et multivariée et identifié TEAD4, SOCS2 et CIT comme les gènes clés associés à la transformation maligne NAFLD / NASH et au pronostic du HCC (Fig. 1E, F). L'analyse de corrélation clinique a montré que l'expression de TEAD4 était corrélée au stade T élevé, au stade et au grade des tumeurs du CHC, que l'expression de SOCS2 était négativement corrélée aux métastases ganglionnaires et au stade T des tumeurs du CHC, et que le CIT était positivement corrélé au stade T et au stade des tumeurs du CHC. (Fig. 1G – M). Parmi eux, TEAD4 (HR = 1,074) et CIT (HR = 1,595) sont des facteurs de risque pour le pronostic du CHC, et leur forte expression conduit à un mauvais pronostic du CHC, tandis que SOCS2 (HR = 0,791) est un facteur de protection, et son une expression élevée améliore le pronostic des patients atteints de CHC (Fig. 1N – P).

Construction d’un modèle pronostique

Ensuite, nous avons construit un modèle de pronostic du risque de CHC via TEAD4, SOCS2 et CIT, et le score de risque = (0,05957332 * expression TEAD4 – 0,233885624 * expression SOCS2 + 0,38039386 * expression CIT). L’analyse de régression univariée de Cox utilisant les données TCGA a montré que le score de risque était un facteur de risque de CHC (HR = 1,519), et l’analyse de régression multivariée de COX a montré que le score de risque était un facteur pronostique indépendant de CHC (HR = 1,436) (Fig. 2A, B). . De plus, les patients atteints de CHC présentant un score de risque élevé présentaient un stade et un stade T plus élevés (Fig. 2C, D). L’analyse de survie a montré que les patients atteints de CHC présentant un score de risque élevé avaient un pronostic plus défavorable que les patients atteints de CHC présentant un score de risque faible (Fig. 2E). Les courbes ROC de 1, 2 et 3 ans (les aires sous la courbe ROC = 0,757, 0,751, 0,704) ont montré que notre modèle pronostique était fiable (Fig. 2F). La figure 2G – I montre l’expression de TEAD4, SOCS2 et CIT dans des échantillons de CHC, ainsi que l’état de survie des patients atteints de CHC en fonction du score de risque.

Construction d’un modèle pronostique. (UN, B) Analyse de régression COX univariée et multivariée basée sur des facteurs cliniques. (C, D) Analyse de corrélation clinique basée sur le score de risque. (E, F) Courbe de survie et courbe ROC basées sur le score de risque. (g–je) Expression des gènes et statut de survie en fonction du score de risque.

Vérification du modèle pronostique

Nous avons ensuite validé notre modèle pronostique avec des ensembles de données externes (ICGC, GSE116174, GSE54236). Nos résultats ont montré que des scores de risque plus élevés étaient associés à moins d’échantillons survivants et à davantage d’échantillons morts (Fig. 3A – I). Le pronostic des échantillons à faible risque était bien meilleur que celui des groupes à haut risque (Fig. 3J – L). Dans l’ensemble de données ICGC, les aires sous la courbe ROC pour 1, 2 et 3 ans sont respectivement de 0,656, 0,656 et 0,659 ; dans l’ensemble de données GSE116174, ils sont 0,604, 0,591 et 0,567 ; dans l’ensemble de données GSE54236, ils sont respectivement de 0,791, 0,670 et 0,798 (Fig. 3M – O). Ces données suggèrent que notre modèle a une excellente valeur pronostique pour les patients atteints de CHC.

Vérification du modèle pronostique. Carte thermique d’expression génique (en utilisant R version 4.2.1 : https://www.r-project.org/) pour les échantillons HCC de l’ICGC (UN), GSE116174 (B) et GSE54236 (C). (D–F) Les évaluations de risque pour les échantillons de CHC dans les trois ensembles de données sont distribuées. (g–je) Relation entre le score de risque, le statut de l’échantillon CHC et la durée de survie dans les trois ensembles de données susmentionnés. (J.–L) Échantillons des catégories à risque élevé et faible dans les courbes de survie de Kaplan – Meier des trois ensembles de données susmentionnés. (M.–Ô) La courbe ROC du score de risque pour les échantillons avec CHC.

Construction et validation du nomogramme

Pour la commodité des cliniciens, nous avons quantifié le modèle pronostique et incorporé d’autres facteurs pronostiques indépendants pour développer le nomogramme. Les nomogrammes pour la SG à 1, 3 et 5 ans sont présentés sur la figure 4A. L’indice de concordance (C-index) du nomogramme était de 0,7 (se = 0,033), ce qui indique dans une certaine mesure un pouvoir prédictif fiable du nomogramme. De plus, les courbes de calibrage à 1, 3 et 5 ans ont montré une grande précision (Fig. 4B – D).

Construction et validation du nomogramme. (UN) Nomogramme montrant les scores de survie pour les facteurs cliniques. (B–D) Courbes de correction montrant l’exactitude prédictive de la survie à 1, 3 et 5 ans.

Les caractéristiques de l’environnement immunologique tumoral et de l’infiltration immunitaire sont fortement corrélées au score de risque

Étant donné que les anomalies immunitaires constituent le mécanisme clé du développement de la NAFLD/NASH en CHC, nous avons effectué une analyse immunitaire basée sur le score de risque des échantillons de CHC. Cartes thermiques montrant la répartition des cellules immunitaires, la fonction immunitaire et le score immunitaire dans les groupes à risque élevé et faible (Fig. 5A). Comparé au groupe à faible risque, le groupe à haut risque présentait un ESTIMATEScore et un SstromalScore inférieurs, mais une TumorPurity accrue, tandis que l’ImmuneScore n’était pas significativement différent (Fig. 5B – E). Grâce à l’analyse ssGSEA, les niveaux d’infiltration des ADC, des macrophages et des cellules Th2 dans le groupe à haut risque ont augmenté, tandis que les niveaux d’infiltration des mastocytes, des cellules NK et des cellules T auxiliaires ont diminué. En termes de voies immunitaires, MCH I a été activé dans le groupe à haut risque, les IFN I et II, ainsi que l’activité cytolytique, ont été inhibés (Fig. 5F). Nous avons découvert grâce à l’analyse de corrélation qu’il existait un lien substantiel entre les marqueurs de risque et les cellules B infiltrantes (r = 0,205), les cellules dendritiques (r = 0,321), les cellules CD4 + T (r = 0,111), les cellules CD8 + T (r = 0,258). ), les macrophages (r = 0,332), les neutrophiles (r = 0,256) (Fig. 5G – L). Ces résultats impliquent que les réponses immunologiques, l’infiltration immunitaire et les signatures TIME sont toutes substantiellement corrélées aux scores de risque de CHC.

Les caractéristiques de l’environnement immunologique de la tumeur et de l’infiltration immunitaire sont fortement corrélées au score de risque. (UN) Carte thermique (en utilisant R version 4.2.1 : https://www.r-project.org/) distribution du score de risque et des différents scores immunitaires. (B–E) Comparaison du score estimé, du score stromal, du score immunitaire et de la pureté tumorale entre les groupes à haut risque et les groupes à faible risque. (F) La relation entre la fonction immunitaire, l’infiltration de cellules immunitaires et le score de risque dans la cohorte TCGA. (g–L) Association entre cette signature et CD4⁺ Cellules T, cellules B, CD8⁺ Cellules T, cellules macrophages, cellules dendritiques et cellules neutrophiles.

Le score de risque est associé à plusieurs voies

Afin de découvrir le mécanisme plus profond du mauvais pronostic des patients du groupe à haut risque, nous avons effectué une analyse d’enrichissement GSEA par score de risque, et les résultats ont montré que KEGG_DNA_REPLICATION, KEGG_BASE_EXCISION_REPAIR, KEGG_RIBOSOME, KEGG_MISMATCH_REPAIR, KEGG_SPLICEOSOME, KEGG_HOMOLOGOUS_RECOMBINATION et d’autres voies étaient activé de manière significative chez les patients du groupe à haut risque (Fig. 6A – F). Dans le groupe à haut risque, plusieurs voies métaboliques telles que KEGG_PRIMARY_BILE_ACID_BIOSYNTHESIS, KEGG_COMPLEMENT_AND_COAGULATION_CASCADES, KEGG_VALINE_LEUCINE_AND_ISOLEUCINE_DEGRADATION, KEGG_FATTY_ACID_METABOLISM, KEGG_PROPANOATE_METABOLISM, KEGG_TRYPTOPHAN_TA ont été significativement inhibées (Fig. 6G–L).

Le score de risque est associé à plusieurs voies. (UN–F) L’analyse GSEA révèle 6 voies dans la base de données KEGG (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)^31,32,33 activé par un groupe à haut risque dans TCGA. (g–L) L’analyse GSEA révèle 6 voies dans la base de données KEGG (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html)^31,32,33supprimé par le groupe à haut risque dans TCGA.

Modèles d’expression des gènes clés de la transformation maligne des lésions hépatiques bénignes dans la NAFLD, la NASH et le CHC

Nous avons ensuite analysé les modèles d’expression de TEAD4, SOCS2 et CIT dans NAFLD, NASH et HCC. Nos résultats ont montré que l’expression de TEAD4 était diminuée dans la NAFLD et la NASH, mais augmentée dans le HCC (Fig. 7A – E). L’expression de SOCS2 était significativement diminuée dans la NAFLD, la NASH et le HCC, indiquant que la faible expression persistante de SOCS2 conduisait à la progression maligne de lésions hépatiques bénignes (Fig. 7G – K). L’expression du CIT a diminué dans deux ensembles de données NAFLD (GSE89632 et GSE126848) et a augmenté dans le HCC (Fig. 7M – O). Cependant, CIT a montré des changements opposés dans deux ensembles de données NASH (GSE17470 et GSE126848) (Fig. 7P, Q). Étant donné que la NASH peut évoluer vers une fibrose hépatique grasse, nous avons émis l’hypothèse que le CIT diminuait dans les premiers stades de la NAFLD et de la NASH, mais que son expression anormalement élevée pouvait médier la fibrose de la NASH. L’analyse de la base de données GSE89632 contenant les données de stadification de la fibrose pour la NASH a montré que l’expression du CIT était significativement plus élevée chez les patients atteints de cirrhose avancée atteinte de NASH que chez les patients précoces, ce qui concorde également avec l’expression élevée du CIT dans le CHC (Fig. 7R). Cependant, il n’y avait pas de différence significative dans les niveaux d’expression de TEAD4 et SOCS2 (Fig. 7F, L). Cela indique que l’expression élevée de CIT peut médier la progression de la fibrose de la NASH, conduisant ainsi à l’apparition et au développement du CHC, et que TEAD4 et SOCS2 peuvent affecter le CHC par des voies autres que la fibrose hépatique.

Modèles d’expression des gènes clés de la transformation maligne des lésions hépatiques bénignes dans la NAFLD, la NASH et le HCC. TEAD4 (UN–F), SOCS2 (g–L) et CIT (M.–R.) niveaux d’expression génique dans les ensembles de données NAFLD, NASH et HCC.

Le CIT est fortement exprimé dans les échantillons cliniques de CHC et associé à un mauvais pronostic

Il n’y a jusqu’à présent aucun rapport de CIT dans le CHC. L’analyse de survie basée sur la base de données TCGA a montré que le taux de survie et le taux de survie sans maladie des patients atteints de CHC présentant une expression élevée de CIT étaient significativement inférieurs à ceux du groupe à faible expression de CIT (Fig. 8A, B). Les données HPA ont également montré une expression protéique élevée du CIT dans les tissus HCC (Fig. 8C). Ensuite, nous avons effectué une détection par qPCR sur 40 cas de tissus de CHC provenant de l’hôpital universitaire de médecine du Guangxi et de leurs tissus paracancéreux appariés, ce qui a montré que le CIT était significativement fortement exprimé dans les tissus de CHC, ce qui a également été confirmé par les résultats du Western-blot (Fig. 8D,E). Et l’expression élevée de CIT était fortement corrélée au mauvais pronostic des patients atteints de CHC (Fig. 8F). Nous avons ensuite constaté que CIT était fortement exprimé dans toutes les lignées cellulaires HCC (Fig. 8G, H). Nous avons construit un modèle de surexpression en utilisant les lignées cellulaires SMCC-7721 et Hep-3B avec l’expression la plus faible (Fig. 8I, J). Le test de prolifération cellulaire et le test CCK8 ont montré que le CIT favorisait de manière significative la capacité de prolifération des cellules HCC (Fig. 8K, L).

Le CIT est fortement exprimé dans les échantillons cliniques de CHC et associé à un mauvais pronostic. (UN) Courbes de survie des patients atteints de CHC de la base de données TCGA. (B) Courbes de survie sans maladie des patients atteints de CHC de la base de données TCGA. (C) Résultats IHC de la base de données HPA montrant l’expression protéique du CIT dans les tissus HCC. L’ARNm (D) et les protéines (E) expression du CIT dans 40 CHC et ses tissus paracancéreux du Guangxi Medical University Cancer Hospital. (F) Courbes de survie de 40 patients atteints de CHC de l’hôpital universitaire de médecine du Guangxi, regroupés en fonction de l’expression du CIT. (g, H) Niveaux d’ARNm et de protéines CIT dans les lignées cellulaires HCC. (je, J.) Établissement du modèle de surexpression CIT. (K, L) Les tests de prolifération cellulaire et CCK8 montrent la capacité de prolifération des cellules HCC.