SOCS2 inhibe les métastases de l’hépatoblastome via une régulation négative de la voie de signal JAK2/STAT5

Analyse pondérée du réseau de co-expression génique

GSE131329 dispose de données cliniques complètes et WGCNA a été réalisé avec ce profil d’expression. WGCNA est une méthode de biologie des systèmes permettant de caractériser les modèles d’association de gènes entre différents échantillons, utilisée pour identifier des ensembles de gènes hautement synergiques et pour rechercher des gènes biomarqueurs candidats ou des cibles thérapeutiques.⁸. Nous avons utilisé le package de fonctions WGCNA du logiciel R pour rechercher des modules génétiques associés aux phénotypes de maladies et avons analysé plus en détail la relation entre ces modules et les échantillons de tumeurs HB. Nous quantifions les associations de gènes individuels avec notre trait d’intérêt (métastase tumorale) en définissant la signification génétique (GS) comme la corrélation entre le gène et le trait. Pour chaque module, nous définissons également une mesure quantitative de l’appartenance au module (MM) comme la corrélation du gène propre du module et du profil d’expression génique. Cela nous permet de quantifier la similarité de tous les gènes du tableau avec chaque module.⁹. Les gènes différentiellement exprimés (DEG) entre HB et le foie normal ont été criblés à partir de GSE131329 avec le package «edgeR». Et des gènes significativement modifiés ont été sélectionnés avec une valeur P <0,05 et un log₂|changement de pli|≥ 1.

Échantillons cliniques

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche biomédicale de l’hôpital de Chine occidentale de l’université du Sichuan et le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants ou de leur tuteur légal. Toutes les informations concernant le matériel humain ont été gérées à l’aide de codes numériques anonymes et les expériences ont été menées suite à la déclaration d’Helsinki. Nous avons collecté des échantillons de patients atteints d’hépatoblastome admis au service de chirurgie pédiatrique de l’hôpital de Chine occidentale de l’université du Sichuan entre janvier 2015 et janvier 2021, et tous les enfants ont subi une intervention chirurgicale ou une biopsie pathologique dans notre service. Au total, 72 enfants atteints d’hépatoblastome ont été inclus dans cette étude et tous les cas présentaient des données cliniques et pathologiques complètes. Des visites de suivi ont été effectuées par téléphone pour clarifier le statut de vie des patients et confirmer l’heure et la cause du décès. La survie globale (SG) est le temps écoulé entre le diagnostic d’un patient et son décès.

Lignées cellulaires et culture cellulaire

Les lignées cellulaires d’hépatoblastome humain Huh6, HepG2 et les cellules hépatiques normales LO2 ont été achetées auprès de la banque de cellules (Académie chinoise des sciences). Le processus de culture cellulaire et de passage implique de changer le milieu tous les 1 à 2 jours. Retirez l’ancien milieu de culture (DMEM additionné de 10 % de FBS) et ajoutez 1,5 ml de trypsine dans le récipient de culture, après 2 min, ajoutez du milieu de culture pour terminer la digestion. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml, centrifuger à 1 000 tr/min pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Ajouter 2 ml de milieu de culture dans le tube à centrifuger, souffler doucement et mélanger le culot cellulaire, puis recueillir la suspension cellulaire. Ajoutez la suspension dans un récipient de culture et placez-la dans un incubateur cellulaire à 37 ℃, 5 % de CO2 pour une culture ultérieure.

Surexpression ectopique de SOCS2 et inhibition des cellules d’hépatoblastome

Pour établir un plasmide de surexpression de SOCS2, la séquence CDS de SOCS2 a été recherchée dans la base de données Pubmed Nucleotide. Les sites des enzymes de restriction ont été analysés et des amorces avec des sites enzymatiques ont été conçues. Le fragment de gène cible a été amplifié en utilisant de l’ADNc comme matrice, traité avec des sites d’enzymes de restriction, un vecteur pCS2 linéarisé, ligaturé avec le fragment, des cellules compétentes DH5α transformées, identifié des clones positifs par PCR et séquençage. Le si-ARN utilisé dans ce projet est acheté auprès de Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Les transfections ont été réalisées par Lipofectamine 8000 (Beyotime, Chine).

PCR quantitative par transcription inverse

L’ARN total est extrait d’un tissu ou d’une cellule à l’aide du réactif Trizol. Ensuite, la transcription inverse de l’ARN a été réalisée avec une amorce de transcription inverse et une transcriptase inverse. La PCR quantitative est mise en place à l’aide de Taq Master Mix (Novoprotein Scientific Inc.), d’amorces, d’un produit de transcription inverse et d’eau sans RNase. L’amplification PCR a été réalisée à 95 °C pendant 5 min, suivie de cycles de 40 cycles à 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 20 s dans un système PCR en temps réel avec SYBR. vert.

Immunohistochimie

Les coupes en paraffine sont déparaffinées et réhydratées avant de restaurer l’antigène à l’aide d’un tampon citrate à haute température. L’activité peroxydase endogène est éliminée avec H₂Ô₂, et l’antigène non spécifique est éliminé avec du sérum de chèvre. La solution de travail d’anticorps primaire est ajoutée et incubée pendant la nuit, suivie de l’anticorps secondaire et de la solution chromogène DAB. Les résultats sont déterminés en fonction de la proportion et de l’intensité des cellules positives, avec un score total de 0 à 6. Le niveau d’expression est classé comme négatif (0 point), faiblement positif (1 à 2 points), modérément positif (3 points) ou fortement positif (4 à 6 points), avec une expression faible définie comme un score total de 0 à 2. et une expression élevée définie comme un score total de 3 à 6.

Western blot

Extraire et préparer des protéines à partir de tissus ou de cellules. Placer le SDS-PAGE à 10 % dans l’appareil d’électrophorèse et charger les échantillons dans les puits. L’électrophorèse est effectuée à une tension constante pour séparer les protéines. Puis transféré la protéine du gel sur une membrane PVDF. L’étape suivante consiste à bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 %, à incuber avec des anticorps primaires et secondaires et à laver la membrane PVDF. La dernière étape consiste à détecter la protéine cible à l’aide d’un système de détection et à analyser les résultats à l’aide du logiciel Image J.

Test de cicatrisation

La procédure de cicatrisation des rayures consiste à marquer une plaque à 6 puits, à ensemencer des cellules HB, à transfecter du si-ARN ou un plasmide et à continuer d’incuber les cellules HB, en grattant les puits avec une pointe de pipette de 200 μL. Laver et imager les cellules après 48 h, et calculer le taux de guérison à l’aide du logiciel Image J.

Tests Transwell

Les cellules sont digérées et mises en suspension dans un milieu sans sérum pour ajuster la concentration à 2 × 10⁵/ml. La chambre inférieure d’une plaque de 24 puits est remplie de milieu contenant 10 % de sérum, tandis que la chambre supérieure est remplie de suspension cellulaire. Après une période d’incubation continue, les chambres sont ensuite fixées avec du méthanol et colorées avec une solution de Giemsa. Après rinçage à l’eau, les cellules situées à la surface supérieure des chambres sont soigneusement éliminées.

Etudes in vivo

L’étude est rapportée conformément aux directives ARRIVE. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives relatives à la recherche animale et approuvées par le comité d’éthique animale de l’hôpital de Chine occidentale du Sichuan University (numéro d’approbation: 20230106004). Au total, 20 souris nues (femelles âgées de 4 à 5 semaines) ont été achetées auprès de Beijing Hfk Biosicence Co., Ltd. et divisées en deux groupes de manière aléatoire (n = 10 par groupe). Les animaux ont été maintenus dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes avec des cycles lumière/obscurité standard de 12 heures, autorisés à manger et à boire à volonté, et euthanasiés sans cruauté dans leurs cages domestiques avec du CO.₂ suivi d’une luxation cervicale. Cellules Huh6 transfectées avec un lentivirus de surexpression SOCS2 (LV-SOCS2-Huh6) ou Ctrl-Lentivirus (LV-NC-Huh6). Et le lentivirus marqué à l’EGFP a été acheté auprès de GENECHEM Co., Ltd. Ensuite, les cellules Huh6 (2 × 10⁵/200 μL) infectés par des lentivirus ont été injectés dans la veine caudale de souris femelles BALB/c-nude. Après 4 semaines, les souris ont été euthanasiées et les poumons ont été prélevés pour prendre des photos. Le système d’imagerie in vivo IVIS® Lumina III pour surveiller les métastases pulmonaires, imagées ex vivo. La luminescence de l’EGFP a été quantifiée en tant que rayonnement moyen à l’aide du logiciel Living Image version 4.0 et de l’outil de région d’intérêt (ROI). Une fois l’imagerie par fluorescence terminée, les poumons ont été fixés dans du formol à 10 % pour la coloration HE.

analyses statistiques

GraphPad Prism9.0 et SPSS25.0 ont été utilisés pour effectuer une analyse statistique. La moyenne ± écart type a été utilisée pour représenter les données quantitatives, et un test t sur échantillon indépendant ou ANOVA a été utilisé pour comparer les groupes. Les données non distribuées normalement ont été représentées à l’aide de la médiane. La corrélation entre l’expression de SOCS2 et les caractéristiques pathologiques cliniques de l’HB a été analysée à l’aide du test du chi carré, avec P <0,05 indiquant une signification statistique.

Approbation éthique et consentement à participer

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche biomédicale de l’hôpital de Chine occidentale de l’université du Sichuan (n° 1085) et le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants ou de leur tuteur légal. Toutes les informations concernant le matériel humain ont été gérées à l’aide de codes numériques anonymes et les expériences ont été menées suite à la déclaration d’Helsinki.