Population étudiée
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considérant que plusieurs cas ont été inclus dans une large série clinique internationale;
ici, nous décrivons les données sur la réponse immunitaire des lymphocytes T de ces participants.
Procédures
Pour évaluer l’impact de l’infection par le monkeypox, la différenciation et l’activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ ont été analysées par cytométrie en flux chez neuf patients (uniquement ceux dont les échantillons étaient disponibles), à l’aide d’un tube de réactif séché (DuraClone IM T cell subsets tube, Beckman Coulter, Hialeah, Floride, États-Unis). Un tube DuraClone contient les anticorps suivants : CD45RA-FITC, CCR7-PE, CD28-ECD, PD1-PC5.5, CD27-PC7, CD4-APC, CD8-A700, CD3-APCA750, CD57-Pacific Blue et CD45- Krome Orange. En bref, 100 μL de sang total frais ont été ajoutés au tube DuraClone et incubés pendant 15 min, à température ambiante. Après incubation, 2 ml de solution de lyse VersaLyse (Beckman Coulter) ont été ajoutés et incubés pendant 15 min. Enfin, les tubes ont été lavés avec 3 ml de PBS 1x, fixés avec du paraformaldéhyde 1x, puis les échantillons acquis par CytoFLEX LX (Beckman Coulter).
L’analyse non supervisée des données cytométriques a été réalisée à l’aide de CATALYST (version 1. 14).
Toutes les données obtenues par cytométrie en flux ont été transformées en R en utilisant l’arcsinus hyperbolique “arcsinh (x/cofactor)” en appliquant des cofacteurs définis manuellement (où x est la valeur d’intensité mesurée de la fluorescence et le cofacteur tel que défini par Melsen et ses collègues
). Le regroupement et la réduction dimensionnelle ont été effectués respectivement à l’aide de FlowSOM et d’algorithmes d’approximation et de projection de variété uniforme, comme décrit précédemment.
Le regroupement a été effectué à l’aide des marqueurs suivants : CD45RA, CCR7, CD27, CD57, PD1, CCR6, CXCR3, CXCR5 et CD69. La réduction dimensionnelle a été réalisée à l’aide des marqueurs suivants : CD45RA, CCR7, CD27, CD57, PD1, CCR6, CXCR3, CXCR5, CD69, CD95 et CD28.
MVA105L : un pool de 74 peptides dérivés d’un balayage peptidique (15 mers avec chevauchement de 11 aa) à travers la protéine de liaison à la surface cellulaire (MVA105L ; numéro d’identification Swiss-Prot : O57211) de la souche VACV Ankara ;
et MVA121L : un pool de 220 peptides dérivés d’un balayage peptidique (15 mers avec chevauchement de 11-aa) à travers la protéine principale P4a (MVA 121L ; numéro d’identification Swiss-Prot : O57223) du virus de la vaccine.
Les PBMC ont été isolés par la technique de gradient standard Histopaque (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Les PBMC cryoconservés ont été décongelés et laissés au repos pendant une nuit à 37°C dans du milieu R10 (RPMI 1640 [Sigma Aldrich]) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal hautement défini inactivé par la chaleur (FBS-HyClone ; Sigma Aldrich), 2 mmol/L de L-glutamine, 10 mmol/L de tampon HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique , Sigma Aldrich), 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Gibco, Waltham, MA, USA). Les PBMC reposés ont été étalés à 3 × 105 cellules par puits dans des plaques ELISpot (Human IFN-γ ELISpot plus kit; Mabtech, Nacka Strand, Suède) et stimulées pendant 18 à 20 h avec un pool de peptides couvrant les 105-L, 074-L et 121-L du MVA (JPT, Berlin, Allemagne) à 37°C (5% CO2). Un mitogène des lymphocytes T (phytohémagglutinine) a été utilisé comme contrôle positif. A la fin de l’incubation, le test ELISpot a été développé selon les instructions du fabricant. La production spontanée de cytokines (fond) a été évaluée en incubant des PBMC avec du DMSO, le diluant des peptides (Sigma Aldrich). Les résultats sont exprimés en cellules formant des taches (SFC) pour 106 PBMC dans des cultures stimulantes après soustraction du bruit de fond. L’évaluation des cytokines (interféron-γ, interleukine [IL]-2, et facteur de nécrose tumorale [TNF]) produit après stimulation spécifique a été réalisé par dosage ELISA automatisé dans des surnageants de cultures stimulées. La limite de détection de ces tests était de 0,17 pg/mL pour l’interféron-γ, 0,54 pg/mL pour l’IL-2 et 0,3 pg/mL pour le TNF.
La quantité d’IL-1β, IL-6, IL-8 et TNF dans le plasma des patients a été quantifiée à l’aide d’immunodosages multiplex automatisés sur Ella (San José, Californie, États-Unis). La limite de détection de ces tests était de 0,16 pg/mL pour l’IL-1β, 0,28 pg/mL pour l’IL-6, 0,19 pg/mL pour l’IL-8 et 0,30 pg/mL pour le TNF.
