Évaluation de l’immunité à long terme et de la protection contre T. gondii après immunisation avec des protéines chimériques recombinantes multivalentes de T. gondii

Animaux

Les souris ont été élevées dans l’animalerie de la Faculté de biologie et de protection de l’environnement de l’Université de Lodz dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Des expériences ont été menées sur des souris mâles C3H/HeOuJ (âgées de 8 à 12 semaines) des laboratoires Charles River (Wilmington, MA, États-Unis). Les animaux (2–3/cage) ont été maintenus dans des conditions stables : température de 21 °C+ /−0,5 à + / − 5 %, 55 % d’humidité, cycle obscurité/lumière 12/12 h, 15–20 échanges d’air par heure et avaient un accès gratuit à l’eau et aux aliments standardisés comme décrit précédemment⁴⁰. Les souris ont été acclimatées pendant 3 à 5 jours avant le début des procédures expérimentales et surveillées tout au long de l’expérience.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par la Commission d’éthique locale polonaise pour les expériences sur les animaux à Lodz (accord 66/ŁB79/2017) et celles-ci étaient conformes à l’acte juridique polonais sur le bien-être des animaux utilisés à des fins éducatives et scientifiques et conformes aux normes européennes Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Le manuscrit a été préparé selon les directives ARRIVE 2.0⁴¹.

Parasites

Le T. gondii La souche DX a été utilisée pour provoquer une infection parasitaire chronique chez des souris C3H/HeOuJ vaccinées expérimentalement et témoins (PBS). Cette souche a été maintenue in vivo chez les souris C3H/HeOuJ et BALB/c. Une souche RH hautement virulente (50174, ATCC, Manassas, VA, USA) maintenue in vivo et une souche Me49 (50611, ATCC, Manassas, VA, USA) maintenue in vitro sur des fibroblastes de prépuce humain (Hs27, CRL-1634, ATCC, Manassas, VA, USA) ont été utilisés pour obtenir des antigènes de lysat de cellules entières solubles dans l’eau (TLA) avec la technique de congélation-décongélation, comme décrit précédemment^42,43.

Production de protéines chimériques recombinantes

Chimère tri- et tétravalent T. gondii les protéines recombinantes SAG2-GRA1-ROP1 (SGR) et SAG1-MIC1-MAG1-GRA2 (SMMG) ont été produites à la suite de l’expression de gènes de fusion composés de trois ou quatre fragments de gènes différents codant pour divers fragments immunodominants de T. gondii antigènes (pour les résidus d’acides aminés SGR 31–170 de SAG2, 26–190 de GRA1 et 85–396 de ROP1 et les résidus d’acides aminés SMMG 49–311 de SAG1, 25–182 de MIC1, 30–202 de MAG1 et 51 –185 de GRA2), comme présenté dans la Fig. 3 supplémentaire. Les antigènes ont été obtenus selon les procédures décrites précédemment^32,44. En bref, les protéines recombinantes SGR et SMMG ont été exprimées sous forme de protéines insolubles avec des masses moléculaires calculées de 72,21 et 83,61 kDa, respectivement. Les cellules bactériennes ont été récoltées par centrifugation (5000×g, 10 min, 4 °C), et les culots de 100 ml de culture ont été remis en suspension dans 30 ml de tampon contenant : urée 5 M, Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazole 5 mM, Triton X-100 0,1 %, pH 7.9 et soniqué. Après centrifugation (12 000×g30 min, 4 °C), les extraits protéiques, obtenus en dissolvant les corps d’inclusion (à l’aide d’urée 5 M), ont été purifiés par Ni²⁺-colonne d’acide iminodiacétique-Sepharose conformément aux instructions du fabricant (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). Les protéines ont été éluées de la colonne en utilisant un tampon sans agent dénaturant (urée) contenant : Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazole 0,5 M, Triton X-100 0,1 %, pH 7,9. Le système d’expression a produit environ 31 et 24 mg de protéines purifiées à partir d’un litre de Escherichia coli Culture Rosetta(DE3)pLacI (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) pour SGR et SMMG, respectivement. La purification a abouti à des préparations de protéines électrophorétiquement homogènes avec une pureté supérieure à 95 %.

Stimulation in vitro des monocytes

Avant d’effectuer le test, les protéines recombinantes ont été testées pour leur éventuelle contamination par les endotoxines après la purification, ce qui peut conduire à des résultats faussement positifs, en utilisant le kit Pierce Chromogenic Endotoxin Quant disponible dans le commerce (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), basé sur Limulus Amoebocyte Lysate Méthode LLA. Pour évaluer le potentiel des antigènes recombinants à déclencher une réponse pro-inflammatoire des monocytes et des macrophages, qui sont importants en tant que cellules APC in vivo, pour induire une réponse spécifique des lymphocytes T, nous avons utilisé des monocytes humains modifiés THP1-Blue (InvivoGen, San Diego, USA) avec NF – Construction de rapporteur SEAP inductible par κB. Les expériences ont été réalisées selon le protocole du fabricant, avec des modifications. En bref, les cellules ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), avec 2 mM je-glutamine, 25 mM HEPES, 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (ATCC, Manassas, VA, États-Unis), 100 μg/ml de normocine (InvivoGen, San Diego, États-Unis), pénicilline–streptomycine (100 U/ml-100 μg /ml) (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne), 10 μg /ml de blasticidine (InvivoGen, San Diego, USA) comme répresseur, à 37 °C, 5 % de CO₂. Pour les tests, un milieu sans blasticidine a été utilisé selon le protocole du fabricant de la cellule. Le réactif QUANTI-Blue (InvivoGen, San Diego, USA) a été utilisé comme chromogène pour déterminer toute activité de phosphatase alcaline dans un échantillon biologique. E. coli Le LPS O55:B5 (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) a été utilisé comme témoin positif à une concentration de 5 ng/ml. Les cellules seules (milieu) ont été utilisées comme contrôle négatif. Pour le test, des plaques de culture tissulaire à 96 puits ont été revêtues en utilisant 5 μg d’antigènes recombinants par puits dans 200 μl de tampon de revêtement stérile (carbonate de sodium 0, 1 M, pH 9, 5) à 4 ° C pendant la nuit. Les puits de milieu et de LPS ont également été traités avec un tampon de revêtement avant l’ensemencement des cellules. L’expérience a été réalisée dans 6 puits pour chaque stimuli et 12 puits pour le milieu. Les puits ont été lavés 3 fois avec du PBS stérile avant l’ajout des cellules. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 9 × 10⁴ par puits, selon le protocole du fabricant, et stimulé pendant 24 h. Après incubation, 20 μl de chaque surnageant cellulaire ont été ajoutés à 180 μl de réactif QUANTI-Blue sur microplaque et incubés pendant 6 h à 37 °C. Après incubation, la densité optique à 650 nm a été lue sur un lecteur de microplaques. La viabilité des cellules après stimulation a également été évaluée à l’aide du test Alamar Blue pour éviter les faux résultats négatifs causés par une éventuelle cytotoxicité des protéines.

Immunisation et provocation des souris

Les souris ont d’abord été réparties au hasard dans des cages, qui ont ensuite été réparties au hasard en quatre groupes (4 souris par groupe pour le test splénocyte/sérologie et 8 à 10 pour le T. gondii défi) et vaccinés par voie sous-cutanée trois fois à deux semaines d’intervalle avec SGR (10 µg/souris), SMMG (10 µg/souris), SGR + SMMG (10 + 10 µg/souris) ou PBS (témoin). Les protéines chimériques/PBS ont été émulsifiées, selon le protocole du fabricant, dans une nanoémulsion huile-dans-eau à base de squalène AddaVax (InvivoGen, San Diego, USA). Toutes les souris étudiées, quel que soit le groupe (contrôle/immunisé), ont subi les procédures en même temps. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées par les mêmes expérimentateurs et un seul d’entre eux était au courant de l’attribution des souris. Deux semaines ou 6 mois après la dernière dose, les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique (injection intrapéritonéale, 200 mg/kg) et euthanasiées par dislocation cervicale pour prélèvement ultérieur d’organes et de tissus. Le sang/la rate obtenus ont été utilisés pour les analyses de sérologie/splénocytes. Les animaux restants ont été provoqués par voie intrapéritonéale avec 5 T. gondii Kystes DX. Les sérums de souris ont été conservés à – 20 °C. L’immunoprotection obtenue par la vaccination a été évaluée un mois après l’infection expérimentale. À cette fin, les cerveaux isolés ont été mécaniquement homogénéisés dans du PBS à un volume final de 2,5 ml et stockés à + 4 °C. Ensuite, dans des échantillons de 25 µl de chaque homogénat, en double, le nombre de T. gondii kystes a été déterminée à l’aide d’un microscope optique inversé. Sur la base de la valeur moyenne, la charge totale de kystes pour 2,5 ml d’homogénat, correspondant à l’ensemble du cerveau de souris, a été calculée. La vaccination et le calendrier des expériences sont présentés dans le diagramme (Fig. 6).

Sérologie

Deux semaines et 6 mois après la dernière immunisation de rappel, les taux d’immunoglobuline ont été déterminés dans des sérums de souris dilués : 1 :100 pour les IgG spécifiques aux TLA des souches RH et Me49 et de 1 :100 à 1 :204 800 pour les IgG2a et IgG1 spécifiques au vaccin. antigènes à l’aide d’un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Les dosages ont été effectués comme décrit précédemment⁴². En bref, des plaques MaxiSorp à 96 puits (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ont été revêtues pendant une nuit avec 100 µl de TLA ou d’antigènes recombinants à une concentration finale de 2 µg/puits. Les puits ont ensuite été bloqués avec du PBS additionné de 10% de FBS (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) et ensuite des sérums dilués ont été ajoutés en double. La réaction a été développée avec les anticorps secondaires conjugués à la HRP : IgG anti-souris de chèvre (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), IgG1 anti-souris de chèvre (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), anti-souris de chèvre IgG2a (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) et le sel de diammonium 2,2-azino-bis(3-éthyl-benzothiazoline6-sulfonique) (ABTS) (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) servant de chromogène. L’absorbance a été mesurée à 405 nm (lecteur ELISA automatique Multiskan EX) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et les titres IgG1 et IgG2a ont été définis, comme la dilution de sérum la plus élevée avec une DO > 0,3.

Dosage des splénocytes

Un dosage des splénocytes a été effectué comme précédemment^32,42. En bref, des rates de souris immunisées et témoins ont été isolées et des suspensions unicellulaires de splénocytes ont été obtenues par homogénéisation mécanique suivie d’une lyse des érythrocytes. Le nombre et la viabilité des splénocytes ont été déterminés par la méthode d’exclusion du bleu trypan en utilisant le compteur de cellules automatisé TC20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Les cellules de chaque souris ont été cultivées dans du milieu Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM) (Cytogen, Zgierz, Pologne), additionné de 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 100 U/ml de pénicilline + 100 µg/ml de streptomycine (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) et stimulé en triple pour chaque souris en utilisant le natif précédemment obtenu T. gondii Antigène de la souche RH TLA à une concentration finale de 10 µg/ml. La concanavaline A à la concentration finale de 2,5 µg/ml (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) a servi de témoin positif, tandis que le milieu de culture seul a servi de témoin négatif. Après 48h (IL-2) ou 72h (IL-10, IFN-γ) d’incubation à 37°C en atmosphère humide avec 10% de CO₂, les surnageants ont été collectés et stockés à – 80 ° C, pour évaluer les concentrations de cytokines sécrétées à l’aide d’ensembles OptEIA ELISA disponibles dans le commerce (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), sur la base de l’analyse de régression log-log, selon le instruction du fabricant. Pour l’analyse statistique, les valeurs de production de cytokines des puits stimulés ont été moyennées, ainsi les valeurs tracées représentent la production moyenne de la souris individuelle.

analyses statistiques

Les graphiques et toutes les analyses statistiques ont été effectués à l’aide de GraphPad Prism 9.4.1 pour Windows (Dotmatics, GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis). Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour évaluer la distribution gaussienne. Le test de Brown-Forsythe a été utilisé pour vérifier l’égalité des variances de groupe. Outre le nombre de kystes, les résultats sont présentés sous forme de valeur moyenne du groupe et de son écart type SD. Les titres d’anticorps ont été transformés de manière logarithmique pour atteindre la normalité. Les résultats qui répondaient aux critères des tests paramétriques, tels que l’activation de la voie NF-κB dans les monocytes humains et les titres d’anticorps, ont été traités à l’aide d’un test d’analyse de variance ANOVA. Les tests post-hoc utilisés pour chaque analyse sont décrits sous chaque graphique. Le test de Kruskal-Walli non paramétrique suivi d’une procédure progressive linéaire en deux étapes de Benjamini, Krieger et Yekutieli post hoc, a été utilisé en cas de données qui ne correspondaient pas aux méthodes paramétriques, telles que le niveau d’anticorps IgG, les dosages de cytokines et les tests de kystes. fardeau. Dans le cas de toutes les analyses statistiques effectuées, alpha α a été fixé à 0,05.