Concentrations urinaires de GHB et de ses nouveaux conjugués d’acides aminés et de carnitine après administration contrôlée de GHB à l’homme

L’interprétation actuelle des concentrations urinaires de GHB doit encore être améliorée, et plusieurs études ont été réalisées pour trouver de nouveaux biomarqueurs^{8,9,dix,11,12,15,16,17,18,19,22,23}. Nous avons récemment proposé de nouveaux conjugués urinaires de GHB avec différents acides aminés ou carnitine (Fig. 1)^17,18, mais il manque des données quantitatives sur des intervalles de temps plus longs après la consommation de GHB. L’étude actuelle est la première à fournir des valeurs quantitatives pour le GHB, ses conjugués et les acides organiques après administration contrôlée de GHB à l’homme.

Étudier les cohortes, les analyses et les concentrations détectées

Des échantillons d’urine de deux cohortes d’étude (79 participants) ont été (ré)analysés. Alors que la cohorte d’étude II consistait en un essai clinique récent (environ 6 mois de stockage à – 80 ° C), la cohorte d’étude I a été stockée pendant env. 8 ans (− 80 °C) avant quantification dans l’étude actuelle. La stabilité à long terme pendant la validation de la méthode a été testée jusqu’à trois mois à − 20 °C. Une tendance à la baisse des concentrations de conjugués d’acides aminés a été observée, mais seule la GHB-carnitine a significativement diminué²¹. En conséquence, la moyenne et la plage des conjugués d’acides aminés du GHB dans les échantillons d’urine prélevés 4,5 h après l’apport de GHB dans la cohorte I de l’étude étaient légèrement inférieures à celles de la cohorte II. Dans l’ensemble, ces résultats prouvent une stabilité suffisante des conjugués d’acides aminés GHB, du moins lorsqu’ils sont stockés à – 80 ° C. Étonnamment, nous avons trouvé des concentrations significativement plus élevées de GHB-carnitine dans la cohorte I par rapport à II (tableau 1). Cependant, la GHB-carnitine s’est avérée instable également dans les échantillons extraits. La substance est hautement hygroscopique et difficile à manipuler dans des conditions de laboratoire standard. Pour éviter les problèmes d’interprétation dus au stockage des échantillons, nous avons concentré l’évaluation des données primaires sur la cohorte d’étude II, compte tenu de la longue collection d’échantillons appariés.

L’isotope 13C d’origine naturelle représente généralement environ 1,1 % de tous les atomes de carbone produisant un signal MS beaucoup plus faible que le 12C, ce qui augmente la plage dynamique.^24,25. Nous avons pu montrer lors de la validation de la méthode que les concentrations de GHB calculées via le ¹³L’isotope C correspond bien aux résultats d’une précédente méthode GHB²¹. La présente étude s’est principalement concentrée sur les nouveaux métabolites du GHB, en particulier sur la différenciation entre les niveaux endogènes et l’apport exogène en GHB. Nous avons donc considéré la ¹³Les résultats C en tant que valeurs approximatives pour les concentrations de GHB dans les échantillons dépassant la plage d’étalonnage sont suffisants et omettent d’autres étapes de dilution.

La question de savoir si les concentrations urinaires quantitatives doivent être ajustées aux niveaux de créatinine est discutée de manière critique²⁶. Dans les échantillons d’urine ponctuels, l’ajustement de la créatinine est souvent recommandé pour tenir compte de l’état de dilution individuel²⁷. En toxicologie clinique et médico-légale, la créatinine urinaire est généralement déterminée comme paramètre de validité^28,29, mais l’interprétation des concentrations urinaires de médicaments ne tient généralement pas compte des taux de créatinine. Nous avons observé une forte corrélation entre les concentrations ajustées à la créatinine et non ajustées, à l’exception des isomères du DHB. En conséquence, nous nous sommes concentrés sur les résultats et la discussion sur les concentrations non ajustées.

Nous avons détecté des conjugués de GHB dans toutes les conditions et à tous les moments de collecte, mais pas dans tous les échantillons d’urine individuels (tableau 1). L’âge, le sexe ou le trouble dépressif n’ont pas influencé les concentrations. Seuls les esters d’acides gras sont restés indétectables dans tous les échantillons d’urine, probablement en raison de leur haute lipophilie et de la faible excrétion rénale qui en résulte.

Pour différencier les niveaux endogènes des résidus d’application exogène, il est nécessaire de connaître les niveaux endogènes et leurs possibles fluctuations intra-/inter-journalières. Nous avons trouvé des fluctuations significatives uniquement pour la succinylcarnitine, tandis que les isomères du DHB et la glycine du GHB ont montré une légère tendance non significative pour des niveaux plus élevés tôt le matin. Dans l’ensemble, les concentrations d’acides organiques de GHB dans les échantillons de placebo se situaient dans des plages similaires à celles publiées précédemment par Kim et al.¹³ et généralement légèrement inférieur par rapport à Jarsiah et al.¹² Pour les nouveaux conjugués GHB, nous fournissons les premières données. Pourtant, davantage d’échantillons sans l’application de GHB doivent être analysés pour déterminer de manière fiable les niveaux endogènes. Des études futures pourraient également viser des LOQ encore plus faibles pour le GHB-phénylalanine et le GHB-taurine.

Suite au traitement au GHB, nous avons trouvé les concentrations les plus élevées au moment de l’échantillonnage le plus précoce. Pour les acides organiques, nos résultats de cette cohorte plus large s’alignent sur les découvertes précédentes de Kueting et al. après prise de GHB chez cinq patients narcoleptiques (22–34 mg/kg de poids corporel)¹⁶. Cependant, par rapport à un nombre limité de cas authentiques (Tableau 1, ForTox pos 1²¹), les concentrations déterminées après des administrations contrôlées (4,5 h) étaient plus faibles pour tous les composés à l’exception de la GHB-carnitine. Jarsiah et al. ont déterminé des concentrations similaires pour les isomères du DHB et le GA dans les cas médico-légaux de GHB (tableau 1, ForTox pos 2¹⁵). Les explications possibles incluent une collecte d’urine plus précoce ou des doses plus élevées de GHB consommées/administrées. Le temps d’échantillonnage par rapport à la prise de médicaments et aux doses ingérées est le plus souvent inconnu dans les affaires médico-légales. Le stockage des échantillons et la stabilité des analytes peuvent également être critiques. Des expériences récentes de stabilité à long terme sur trois mois ont indiqué des augmentations significatives des niveaux de 2,4- et 3,4-DHB chez les cas GHB-positifs, mais pas chez les cas GHB-négatifs. Cependant, cet effet n’a pas été démontré pour les conjugués GA ou GHB²¹.

Les concentrations de métabolites du GHB, à l’exception du GHB-carnitine, du SA et de la succinylcarnitine, ont montré une forte corrélation avec celles du GHB, en particulier aux concentrations les plus élevées obtenues par application exogène. Nous avons observé une corrélation plus faible à des moments ultérieurs (28 h), où les concentrations ont une forte probabilité d’être d’origine endogène, en particulier pour les acides organiques (Fig. 2). Pour le 3,4-DHB, les pentes entre les corrélations d’origine exogène et endogène semblent différer. Les concentrations de conjugué ou d’acide organique plusieurs heures après l’ingestion de GHB ne dépendaient pas de la concentration initiale de GHB. Cependant, malheureusement, seuls trois points temporels étaient disponibles, ce qui n’a pas permis de calculer les taux d’élimination et la cinétique sous-jacente. Deuxièmement, le premier échantillon d’urine a été prélevé à 4,5 h, ce qui ne reflète pas nécessairement la concentration maximale atteinte dans les urines.

Par conséquent, sur la base des données contrôlées disponibles, il ne peut être totalement exclu que des doses plus élevées de GHB n’entraînent (pas) des concentrations plus élevées de conjugués de GHB, qui peuvent également être associées à une détectabilité plus longue.

Différenciation basée sur les concentrations/valeurs seuils (stratégie a)

Les concentrations moyennes de GHB étaient inférieures aux seuils de GHB recommandés de 10 ou 6 µg/mL déjà 11 h après l’ingestion, ce qui est conforme aux fenêtres de détection connues du GHB⁴. Néanmoins, les concentrations étaient encore statistiquement significativement plus élevées qu’après le placebo. Recherche exploratoire initiale de biomarqueurs^17,18 ont fait naître l’espoir que les conjugués d’acides aminés du GHB ne se produisent pas de manière endogène, ce qui en fait des candidats idéaux comme marqueurs exogènes du GHB. Cependant, les méthodes de détection analytique plus sensibles de la présente étude ont également révélé de faibles niveaux endogènes de ces conjugués. Le GHB-pentose était le seul analyte à peine présent dans les échantillons d’urine placebo (< 10 %) mais toujours détectable après 28 h (Fig. S6 supplémentaire). Malheureusement, aucun matériau de référence n'est disponible et sans validation et quantification de la méthode pour ce paramètre, les conclusions restent limitées. Il en va de même pour le composé encore inconnu U4. Étant clairement liée à l'administration du GHB, l'élucidation de la structure est essentielle pour d'autres études¹⁷.

Sur la base de la concentration endogène la plus élevée par analyte détectée dans les échantillons d’urine du traitement placebo (égale à 100 % de spécificité), nous avons choisi des valeurs seuils pour les métabolites du GHB et les avons testés pour leur sensibilité à détecter l’apport de GHB à différents moments. De plus, si les concentrations dans les échantillons authentiques (tableau 1) dépassaient celles des cohortes d’études contrôlées, un deuxième seuil plus élevé, égal ou très similaire à une publication précédente a été évalué¹⁵. La GHB-glycine (seuil provisoire de 1 µg/mL) se distingue comme le biomarqueur le plus prometteur qui peut prolonger la fenêtre de détection du GHB à environ 28 h, mais toujours pas avec la sensibilité souhaitée, idéalement proche de un. Kueting et al. ont décrit des concentrations urinaires élevées ajustées en fonction de la créatinine de 2,4-DHB, 3,4-DHB et GA après l’apport de GHB pendant jusqu’à 22 h par rapport à une concentration endogène initiale appariée au patient avant l’apport de GHB¹⁶. Ces résultats n’ont pas pu être confirmés dans notre ensemble de données. Seul le 3,4-DHB a permis une identification correcte de l’apport de GHB pendant environ 11 h, mais toujours avec une faible sensibilité (14 %). Fait intéressant, les mêmes échantillons d’urine (H19, H20, H21, P21 et P25) avaient des concentrations plus élevées de GHB, GHB-glycine, GHB-pentose et 3,4-DHB par rapport aux autres participants, en particulier à 11 h et parfois après 28 h (Fig. S6 supplémentaire). Jusqu’à présent, cette découverte n’a pas pu être expliquée, mais s’est avérée indépendante de l’âge, du sexe, de la co-médication ou de la créatinine urinaire.

Différenciation basée sur les ratios de métabolites (stratégie b)

L’administration de GHB entraîne des concentrations urinaires de GHB plusieurs fois plus élevées par rapport aux niveaux endogènes. Par conséquent, le calcul des MR des métabolites du GHB sur les concentrations de GHB produira initialement des MR extrêmement faibles par rapport au placebo, augmentant ou dépassant les ratios endogènes au fil du temps (Fig. 4). Si les métabolites du GHB sont éliminés plus lentement que le GHB, les MR correspondants à des moments ultérieurs devraient dépasser ceux des cas sans apport de GHB. De tous les MR évalués, seul le GHB-glycine a suivi cette tendance attendue, tandis que les valeurs médianes se situaient toujours dans les limites du placebo. La sélection de l’IQR MR le plus élevé du traitement placebo comme limite provisoire a entraîné une sensibilité légèrement supérieure, mais toujours trop faible, pour une détection correcte de l’apport de GHB dans des échantillons d’urine de 28 h par rapport au seuil de concentration unique.

Différenciation basée sur des seuils d’élévation entre deux échantillons d’urine (stratégie c)

Comme troisième approche de discrimination, nous avons testé une détermination de ratio entre deux échantillons d’urine d’un même individu, tenant compte du niveau endogène d’un individu. Nous avons utilisé des échantillons de placebo appariés dans le temps pour une évaluation préliminaire afin d’éviter la variation intra-journalière de l’analyte. La méthode analytique n’était pas suffisamment sensible pour obtenir des valeurs quantitatives dans tous les échantillons de placebo pour les conjugués de GHB. La formation du rapport sur la base des concentrations calculées n’a donc pas été possible dans suffisamment de cas. Au lieu de cela, nous avons utilisé des rapports de surface de pic (analyte/étalon interne (IS)), avec l’avantage supplémentaire qu’aucun matériau de référence n’est nécessaire. Ces normes ont été en partie synthétisées en interne et ne sont pas encore disponibles dans le commerce³⁰. Les différences d’abondance dans les échantillons d’urine placebo (4,5 h contre 28 h) ont été utilisées comme une cohorte sans GHB exogène et ont montré des élévations maximales de 5 (exception GHB, GHB-glutamate, GHB-phénylalanine, SA). Cinq a donc été retenu comme seuil d’élévation potentiel. Les composés non détectables dans les échantillons individuels ont reçu un rapport surface de pic fictif/IS de 0,00001 (facteur minimum 100 inférieur aux valeurs d’échantillon authentiques les plus basses) pour contourner la division par zéro erreur. Cette approche a donné une sensibilité beaucoup plus élevée, également 28 h après la prise de GHB. Des valeurs de spécificité plus faibles ont été observées en raison de paires d’urine (placebo) où les analytes étaient indétectables dans l’un des échantillons. Dans ces circonstances, des taux déjà très bas dans les premiers prélèvements d’urine conduiraient à une élévation théoriquement infinie. En prenant le GHB-glycine comme exemple, la suppression des six paires avec du GHB-glycine indétectable dans l’un des échantillons a de nouveau augmenté la spécificité de 0,85 à 1. Nos données préliminaires suggèrent que la comparaison avec un deuxième échantillon d’urine pourrait être la meilleure stratégie pour améliorer la détection du GHB. . Pourtant, davantage de données, confirmant les seuils d’élévation proposés et évaluant les résultats d’échantillons de cas de routine en double sont nécessaires. Par conséquent, nous vous recommandons de prélever des échantillons d’urine 24 h (synchronisés) après l’échantillon initial.

Limites

Notre étude présentait certaines limites car les échantillons réanalysés provenaient d’études qui n’avaient pas été initialement conçues pour notre question de recherche. De plus, une dose thérapeutique de GHB (narcolepsie) a été administrée, alors que des doses plus élevées sont couramment utilisées dans les cas de DFSA. Seuls trois points de temps de collecte jusqu’à 28 h étaient disponibles, ne permettant pas une analyse pharmacocinétique appropriée (par exemple, le taux d’élimination).