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Développement d’un nouveau test colorimétrique pour le diagnostic rapide de la maladie à coronavirus 2019 à partir d’échantillons nasopharyngés

Développement d’un nouveau test colorimétrique pour le diagnostic rapide de la maladie à coronavirus 2019 à partir d’échantillons nasopharyngés

2024-05-27 19:09:41

Déclaration d’éthique

Des échantillons d’échange nasopharyngé (n = 200) ont été collectés à l’hôpital de l’Université des sciences médicales de Fasa, en Iran (conservés dans un milieu de transport de virus (VTM)) conformément aux directives approuvées et aux réglementations en vigueur. Tous les sujets ont fourni leur consentement éclairé écrit avant de participer à l’étude. Le comité d’éthique de l’Université des sciences médicales de Fasa a approuvé toutes les procédures expérimentales (IR.FUMS.REC.1399.041). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées.

Extraction d’ARN

L’ARN génomique du COVID-19 a été extrait de 160 µL d’écouvillons nasopharyngés des cas suspects à l’aide des kits d’ARN viral QIAamp (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément au protocole du fabricant. Après élution dans de l’eau sans RNase, les échantillons d’ARN ont été conservés en aliquotes de 20 µL à – 80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

Test PCR en temps réel

Afin de détecter le SRAS-COV-2 dans les cas suspects, un kit RT-PCR commercial (kit de détection en temps réel nCoV, Sansure Biotech) a été utilisé. La RT-PCR a été réalisée selon les instructions des fabricants. Un mélange réactionnel total de 50 µL contenait 20 µL de matrice d’ARN, 26 µL de mélange nCov-PCR et 4 µL de mélange nCov-PCR-Enzyme. Le test RT-PCR a été réalisé à 50 °C pendant 30 min pour la transcription inverse, suivi de 95 °C pendant 1 min, puis de 45 cycles à 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s en recrutant le système BioRad (CFX96 Touch Systèmes de détection PCR en temps réel). La RT-PCR avec une valeur CT > 39 a été considérée comme un résultat négatif.

Synthèse et caractérisation des AuNP

Des AuNP coiffées de citrate d’un diamètre moyen d’environ 20 nm ont été synthétisées avec succès à l’aide d’un protocole bien établi . Après avoir été préparée, une solution de 50 ml contenant 0,7 mM de HAuCl4 a été chauffée au reflux. Sous agitation vigoureuse, 5 ml de citrate trisodique 25,9 mM ont été rapidement ajoutés à la solution une fois qu’elle a atteint le point d’ébullition. Ensuite, le reflux a été poursuivi pendant 30 minutes. La couleur de la solution est devenue rouge foncé, ce qui a confirmé la formation d’AuNP et laissée à température ambiante. La concentration finale de la particule a été estimée à 10 nM sur la base de la loi de Beer appliquant un coefficient d’extinction des AuNP de 20 nm à 524 nm18,19. La solution d’AuNP synthétisée a été stockée dans un endroit sombre et frais (4 °C) pour une utilisation ultérieure. La distribution de la longueur des particules (SPAN) et les valeurs de diamètre moyen de la taille des particules (ps) des AuNP ont été déterminées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (diffuseuroscope, OK-ONE NANO. LTD, Corée). La morphologie, la taille et la caractérisation des particules ont été étudiées à l’aide du microscope électronique à transmission (TEM) (Libra 120 TEM) en considérant une tension accélératrice de 400 kV.

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Conception de la sonde

Une sonde oligonucléotidique synthétique de 20 bases a été conçue selon la séquence déposée dans GenBank (NC_045512) tournant autour de l’ORF1ab du COVID-19 comme gène cible. La sonde a été conçue pour détecter spécifiquement l’agent COVID-19. L’outil d’alignement local de base (BLAST) a été utilisé en utilisant la base de données du Centre national d’information sur la biotechnologie (NCBI). Ensuite, un groupe thiol a été ajouté à l’extrémité 5’ de la sonde, facilitant sa conjugaison avec les AuNP colloïdaux. Le 5′Thiol-CTGCGGTATGTGGAAAGGTTATG-3 ‘a été acheté auprès de la société Bioneer (Corée du Sud).

Fonctionnalisation des AuNPs avec sonde rapporteur

Afin d’activer la sonde thiolée, les groupes thiol ont été réduits en la remettant en suspension avec 20 µL de Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) (0,2 M/L) à température ambiante pendant une heure. L’étape suivante du processus était l’intégration de la sonde avec les AuNP, comme décrit précédemment . Ensuite, 1 000 µL d’AuNP du mélange et 20 µL d’oligonucléotide modifié au thiol ont été vortexés pendant une nuit à température ambiante dans l’obscurité. Avant d’ajouter la solution de SDS, la concentration de la solution était de 9 mmol/L dans un tampon phosphate de sodium de pH 7. L’ajout de la solution de SDS à une concentration de 0,1 % avait pour but d’éviter l’agrégation.

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Le volume de tampon de salage (NaCl 2 M dans PBS PH 7 10 mM) qui a été divisé en six doses a été ajouté progressivement à la solution à température ambiante pendant 2 jours. Pour maximiser l’empaquetage de l’ADN, une sonication des particules pendant 30 secondes était nécessaire après chaque ajout de sel.

Après avoir été centrifugé à 16 000 g pendant 30 min à 4 °C, le précipité a été lavé avec 500 µL et remis en suspension dans 200 µL de tampon de lavage (NaCl 1,5 mM, 0,1 % SDS dans un tampon PBS) avant d’être stocké à 4 °C dans un endroit sombre. . Les AuNP fonctionnalisés par l’ADN et la suspension d’AuNP pure doivent présenter la même couleur. Pour confirmer la conjugaison AuNPs-sonde, le test d’agrégation induite par le sel a été réalisé. Dans ce test, 5 µL de sondes et AuNP ont été mélangés séparément avec 1 µL de MgCl2 (5 mM) pendant 10 min, sans aucun changement de couleur observé21,22.

Test colorimétrique AuNPs

Les tests colorimétriques ont été mis en œuvre dans un volume total de 20 µL pendant 30 min, comprenant un processus par lequel l’ARN génomique du COVID-19 a pu être détecté. La procédure a commencé par chauffer 10 µL d’échantillon d’ADN cible à 95 °C pendant 5 min, suivi d’un refroidissement immédiat des tubes à essai par la glace. Avant d’être incubé à 63 ° C pendant 10 min, 4 µL de la sonde AuNPs ont été ajoutés et mélangés à la solution. La phase finale du processus s’est produite 10 minutes plus tard, impliquant l’ajout de 5 µL de HCl 0,2 N à la réaction. Le même protocole a été mis en œuvre pour préparer un contrôle à blanc sans séquence cible. Après avoir été laissés à température ambiante pendant 5 minutes, les mélanges ont développé la couleur souhaitée, qui a pu être détectée à l’œil nu et confirmée par un spectre d’absorption21,22.

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Limite minimale de détection (MDL)

Pour évaluer la limite minimale de détection et la quantification de l’ARN génomique du COVID-19, une dilution en série d’un contrôle positif (200 000 copies par µL) disponible dans le kit de diagnostic du coronavirus (QIAamp Viral RNA Kits) a été préparée et examinée. Ensuite, une courbe standard a été obtenue à partir des 10 échantillons positifs au COVID-19. La RT-PCR a été réalisée sur les échantillons et le nombre de copies a été déterminé sur la base de la courbe standard. Dans ce qui suit, une dilution en série de deux à partir d’échantillons mélangés a été réalisée. Le nombre de copies des 10 échantillons était de 50 000 nombres de copies/µL.

Analyse d’échantillons cliniques

Au total, 200 échantillons ont été collectés auprès de patients de même sexe et âgés en moyenne de 52 ans et analysés par RT-PCR, 100 d’entre eux ont été confirmés comme patients infectés par le COVID-19. Ces personnes RT-PCR négatives n’ont eu aucun contact avec des patients atteints du COVID-19 et n’ont pas non plus migré vers des lieux suspects. Pour s’assurer qu’ils n’étaient pas infectés, les individus ont été sélectionnés parmi des groupes qui avaient l’intention de voyager à l’étranger ou de rejoindre le service militaire. Lors de la sélection des patients, il a été assuré qu’outre le test RT-PCR positif, tous présentaient une gamme de symptômes cliniques du COVID-19, allant de légers à graves. Nous avons également effectué le test sur 20 échantillons positifs pour la grippe et 20 échantillons positifs pour le RSV, qui ont tous été détectés comme négatifs.

Approbation éthique et consentement à participer

Les auteurs confirment que toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par l’Université des sciences médicales Fasa. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets et/ou de leur(s) tuteur(s) légal(s).



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