Virus d’Akabane : Des Chercheurs Créent un Test Rapide RT-RPA et CRISPR

Une nouvelle approche intégrée pour le dépistage d’Akabane

L’organisme Animals and Zoonoses a publié des travaux décrivant l’association de la transcription inverse couplée à l’amplification isotherme par recombinase polymérase et du système CRISPR/Cas12a. Cette technologie vise à identifier de manière spécifique et rapide le virus d’Akabane, désigné sous l’acronyme AKAV, un pathogène à ARN simple brin de polarité négative. La mise en place de ce système en tube unique simplifie grandement les protocoles de laboratoire habituels.

Le déroulement complet de l’analyse ne prend que 50 minutes et s’exécute à une température de 37 °C. Pour la lecture des résultats, les utilisateurs peuvent s’appuyer soit sur une détection par fluorescence, soit sur l’utilisation de bandelettes de test par chromatographie sur flux latéral, offrant ainsi une flexibilité d’utilisation notable sur le terrain.

Les étapes fondamentales de la détection moléculaire des micro-organismes

Le fonctionnement des technologies de diagnostic rapide basées sur les systèmes CRISPR repose sur trois séquences opérationnelles indispensables : l’extraction des acides nucléiques, l’amplification isotherme et enfin la détection du produit cible, comme l’explique la revue des données scientifiques disponibles sur PMC.

L’extraction initiale constitue traditionnellement un défi majeur en raison de la fragilité de l’acide ribonucléique face aux nucléases extérieures. Diverses méthodes de lyse cellulaire existent pour libérer le matériel génétique :

• Des procédés physiques tels que l’ébullition, l’utilisation de billes avec agitation mécanique, les vibrations ultrasonores, le broyage à l’azote liquide et les cycles de congélation-décongélation.
• Des méthodes chimiques faisant appel à des solvants organiques, à l’hydroxyde de sodium, au bromure de cétyltriméthylammonium ou à des mélanges de thiocyanate de guanidinium et de phénol.
• Des techniques biologiques utilisant des enzymes spécifiques comme le lysozyme et la protéinase K pour digérer les débris cellulaires.

Cependant, nombre de ces interventions traditionnelles exigent l’utilisation d’une centrifugeuse, ce qui complique leur déploiement immédiat en milieu rural ou dans les zones aux ressources limitées. Face à cette contrainte, des solutions alternatives de prétraitement ont émergé au fil des ans pour s’affranchir des procédures lourdes.

Évolution des méthodes d’extraction et contraintes techniques

Les chercheurs continuent d’explorer des solutions pour rendre l’extraction des acides nucléiques plus robuste et adaptée aux plateformes de type CRISPR. En 2018, une avancée importante a vu le jour avec l’introduction de la méthode HUDSON, consistant à chauffer des échantillons diagnostiques non extraits pour inactiver les nucléases. Cette technique met en œuvre une première incubation de l’échantillon avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique et un agent réducteur, le TCEP, à une température comprise entre 37 °C et 50 °C pendant cinq à vingt minutes.

Cette première phase permet de dissoudre les particules biologiques et d’éliminer l’activité des nucléases. Elle est suivie d’une réaction thermique menée entre 64 °C et 95 °C pendant cinq minutes afin de libérer le matériel génétique par destruction des enveloppes bactériennes ou virales. Bien que cette innovation réduise considérablement le temps de manipulation, elle présente des limites, notamment la nécessité d’une étape thermique exigeante et une sensibilité moindre sur certains fluides biologiques comme l’urine ou le sérum.

L’amplification isotherme demeure quant à elle la méthode privilégiée pour décupler rapidement les séquences cibles et creuser l’écart entre le signal détectable et le bruit de fond, garantissant ainsi la fiabilité de la lecture finale lors du diagnostic des infections pathogènes.