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Une nouvelle plateforme de dépistage génétique intégrative offre un aperçu du rôle de l’accessibilité de l’ADN dans le cancer

by Nouvelles

Dans une nouvelle ressource pour la communauté scientifique, publiée aujourd’hui dans Biotechnologie de la nature, des chercheurs du laboratoire de Neville Sanjana, PhD, du New York Genome Center (NYGC) et de l’Université de New York (NYU) ont développé CRISPR-sciATAC, une nouvelle plateforme de criblage génétique intégrative qui capture conjointement les perturbations génétiques CRISPR et l’accessibilité de la chromatine unicellulaire à l’échelle du génome.

Avec cette technologie, ils dressent le profil des changements dans l’organisation du génome et créent un atlas à grande échelle de l’impact de la perte d’enzymes altérant la chromatine sur le génome humain. La nouvelle méthode exploite la programmabilité du système d’édition de gènes CRISPR pour éliminer en parallèle presque tous les gènes liés à la chromatine, offrant aux chercheurs des informations plus approfondies sur le rôle de l’accessibilité de l’ADN dans le cancer et dans les maladies rares impliquant la chromatine.

Les progrès récents des technologies unicellulaires ont donné aux scientifiques la possibilité de profiler la chromatine, le complexe d’ADN et de protéines qui réside dans le noyau de cellules individuelles. La chromatine est souvent appelée le «gardien» du génome parce que ses protéines agissent comme des éléments d’encapsidation pour l’ADN, en favorisant ou en refusant l’accès à celui-ci.

Cela contrôle les processus d’expression génique dans la cellule, tels que l’activation ou la désactivation de gènes spécifiques. Les changements dans le paysage de la chromatine ont été liés à divers traits et maladies humains, notamment le cancer.

Dans une première démonstration de CRISPR-sciATAC, l’équipe de Sanjana Lab a conçu une bibliothèque CRISPR pour cibler 20 gènes modificateurs de la chromatine qui sont couramment mutés dans différents cancers, y compris les cancers du sein, du côlon, du poumon et du cerveau.

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Beaucoup de ces enzymes agissent comme des suppresseurs de tumeurs et leur perte entraîne des changements globaux dans l’accessibilité de la chromatine. Par exemple, le groupe a montré que la perte du gène EZH2, qui code pour une histone méthytransférase, entraînait une augmentation de l’expression génique à travers plusieurs gènes de développement précédemment étouffés.

L’échelle de CRISPR-sciATAC rend cet ensemble de données très unique. Ici, dans un contexte génétique uniforme, nous avons des données d’accessibilité capturant l’impact de chaque gène lié à la chromatine. Cela fournit une carte détaillée entre chaque gène et comment sa perte affecte l’organisation du génome avec une résolution unicellulaire. “

Dr Noa Liscovitch-Brauer, co-auteur de l’étude et chercheur postdoctoral, Sanjana’s Lab, New York Genome Center et NYU

Au total, l’équipe a ciblé plus de 100 gènes liés à la chromatine et a développé un «atlas de la chromatine» qui montre comment le génome change en réponse à la perte de ces protéines. L’atlas montre que différentes sous-unités au sein de chacun des 17 complexes de remodelage de la chromatine ciblés peuvent avoir des effets différents sur l’accessibilité du génome.

Étonnamment, presque tous ces complexes ont des sous-unités où la perte déclenche une accessibilité accrue et d’autres sous-unités avec l’effet inverse. Dans l’ensemble, la plus grande perturbation des sites de liaison aux facteurs de transcription, qui sont des éléments fonctionnels importants dans le génome, a été observée après la perte de la protéine 1A contenant un domaine interactif riche en AT (ARID1A), membre du complexe BAF. On estime que les mutations des protéines du complexe BAF sont impliquées dans 1 cancer sur 5.

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En plus de la méthode CRISPR-sciATAC, l’équipe a également développé une suite de méthodes de calcul pour cartographier les mouvements dynamiques des nucléosomes, qui sont les grappes de protéines autour desquelles l’ADN est enroulé. Lorsqu’il y a plus de nucléosomes, l’ADN est étroitement enroulé et moins disponible pour se lier aux facteurs de transcription.

C’est exactement ce que l’équipe a trouvé sur des sites spécifiques de liaison aux facteurs de transcription impliqués dans la prolifération cellulaire après le knock-out de CRISPR. ARID1A. Lors du ciblage d’une autre enzyme modifiant la chromatine, ces mêmes sites ont subi une expansion de l’espacement des nucléosomes, démontrant la dynamique du positionnement des nucléosomes à des sites spécifiques du génome.

La méthode CRISPR-sciATAC a permis à l’équipe d’explorer systématiquement cette plasticité du génome pour de multiples enzymes modifiant la chromatine et sites de liaison aux facteurs de transcription.

«Nous nous sommes vraiment attachés à faire de CRISPR-sciATAC une technique accessible – nous voulions que ce soit quelque chose que n’importe quel laboratoire puisse faire. Nous avons produit la plupart des enzymes clés en interne et utilisé des méthodes simples d’isolement monocellulaire qui ne nécessitent pas de microfluidique ou des kits unicellulaires », a déclaré le Dr Antonino Montalbano, ancien boursier postdoctoral du laboratoire de Sanjana au New York Genome Center et à NYU et co-premier auteur de l’étude.

Pour développer la technologie CRISPR-sciATAC, les chercheurs ont utilisé un mélange de cellules humaines et de souris pour créer un processus de marquage / identification qui leur a permis de diviser et de coder les noyaux des cellules ainsi que de capturer les ARN à guide unique requis pour le ciblage CRISPR.

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Le travail s’appuie sur des travaux d’indexation combinatoire ATAC-seq (sciATAC-seq) antérieurs du Dr Jay Shendure de l’Université de Washington et d’autres groupes développant de nouvelles méthodes de génomique unicellulaire. CRISPR-sciATAC utilise également une transposase unique et facile à purifier qui a été développée dans le laboratoire de technologie d’innovation du NYGC.

Un obstacle technique clé a été l’optimisation des conditions expérimentales pour capturer simultanément les ARN guides CRISPR et les fragments de génome pour le profilage d’accessibilité tout en gardant l’enveloppe nucléaire de chaque cellule intacte.

“L’intégration du profil d’accessibilité de la chromatine dans les écrans CRISPR à l’échelle du génome nous permet de comprendre la régulation des gènes”, a déclaré le Dr Sanjana, membre principal du corps professoral, NYGC, professeur adjoint de biologie, NYU, et professeur adjoint de neurosciences et physiologie, NYU Grossman School of Medicine, auteur principal de l’étude.

«Avec CRISPR-sciATAC, nous avons une vision globale de la façon dont des enzymes et des complexes modifiant la chromatine changent l’accessibilité et orchestrent les interactions qui contrôlent l’expression des gènes. La chromatine prépare le terrain pour l’expression des gènes, et ici nous pouvons mesurer l’impact de différentes mutations sur Nous espérons que cet atlas sera une ressource largement utile pour la communauté et que CRISPR-sciATAC sera utilisé pour produire des atlas similaires dans d’autres systèmes biologiques et contextes de maladies. “

La source:

Référence du journal:

Liscovitch-Brauer, N., et al. (2021) Profilage des déterminants génétiques de l’accessibilité de la chromatine avec des écrans CRISPR monocellulaires évolutifs. Biotechnologie de la nature. doi.org/10.1038/s41587-021-00902-x.

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