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Optimisation des spores de Bacillus pour les évaluations d’efficacité sporicide

Une étude révèle que différents Bacille les souches sporulent mieux dans différents milieux et conditions, établissant des paramètres optimaux pour produire des spores pour les études d’efficacité des désinfectants.

Gros plan sur des colonies blanches/grises de Bacillus subtilis sur une plaque de gélose au sang

Les spores bactériennes sont une préoccupation importante pour les fabricants de produits pharmaceutiques aseptiques en raison de leur nature omniprésente et de leur résistance intrinsèque aux facteurs de stress environnementaux tels que la chaleur, ainsi qu’aux stratégies d’inactivation chimique et par rayonnement.

Jusqu’à 10 % des microbes dans une salle blanche pharmaceutique sont des bactéries sporulées, avec des souches telles que Bacille espèces capables de provoquer des maladies chez l’homme. Bacille Les spores sont une préoccupation majeure pour les fabricants de médicaments et les préparateurs car ils sont souvent résistants aux procédures de désinfection, ils sont donc couramment choisis comme organismes représentatifs pour les évaluations de l’efficacité sporicide.

Selon un article récent, sans standardisation, la faible qualité des Bacille les spores utilisées dans les évaluations d’efficacité peuvent entraîner des scores sporicides faussement positifs. Par conséquent, les auteurs ont entrepris de comparer et d’optimiser les méthodes conventionnelles de sporulation et de purification pour sept Bacille espèces couramment sélectionnées pour les évaluations sporicides.

Les espèces sélectionnées étaient B. cereus (ATCC 14579), B. licheniformis (ATCC 14580), B. pumilus (ATCC 7061), B. sphaericus (ATCC 14577 et ATCC 6051), B. subtilis (ATCC 19659) et B. thuringiensis (ATCC 35646).

Conditions des médias et de la culture

L’équipe a découvert que « un bouillon de sporulation et des conditions de culture spécifiques sont nécessaires pour produire des spores de haute qualité dans différentes Bacille souches.

Sur les cinq milieux de sporulation différents évalués, quatre des souches (B. pumilus, B. sphaericuset les deux B. subtilis) a préféré le milieu de sporulation Difco.

B cereus et B. thuringiensis ont observé leurs taux de sporulation maximum, 90 et 50 % respectivement, avec des milieux supplémentés en glucose de Schaeffer (2XSG) à concentration élevée en Mn2+ (100 μM).

L’incubation à 30°C plutôt qu’à 37°C s’est avérée augmenter les niveaux de sporulation de B. cereus, B. sphaericus et B. thuringiensis à leurs taux de sporulation maximum de 90, 70 et 50 pour cent, respectivement.

En revanche, B. licheniformis a atteint son taux de sporulation le plus élevé de 80 pour cent avec à la fois la température plus élevée de 37 ° C et un milieu de sporulation dur, Mn2+-bouillon modifié à 10 % de bouillon Columbia (MAC).

Évaluation de la qualité des spores

Selon les auteurs, “avant d’être soumis à des tests sporicides, la qualité de la spore bactérienne doit être évaluée, y compris le titre, la pureté et la résistance au NaOCl”.

Ils ont établi une série de qualifications pour Bacille spores à envisager pour une utilisation dans des essais sporicides, y compris :

  • un titre de spores de 2–3 × 109UFC/ml
  • une pureté des spores de ≥90 pour cent
  • réduction logarithmique de > 5 UFC/ml contre 5 000 ppm de NaOCl et < 3 UFC/ml contre 1 500 ppm de NaOCl avec un temps de contact de 10 minutes.

Alors que six des souches répondaient à ces paramètres, la pureté maximale atteinte pour B. thuringiensis était d’environ 68 %, de sorte que les auteurs suggèrent qu’il ne s’agit peut-être pas d’un organisme de test approprié.

Li et coll. également établi que les périodes de maturation optimales sont de 7 à 21 jours à 4°C pour Bacille spores.

Optimisation des procédés de purification

La résistance au NaOCl a été utilisée pour déterminer si les processus de purification causaient des dommages aux spores.

Pour déterminer si le traitement thermique affecte la qualité des spores, les suspensions de spores ont été chauffées pendant cinq, 10 ou 20 minutes dans des bains-marie à trois températures (65°C, 70°C ou 80°C), puis soumises à un test de résistance au NaOCl. B. licheniformis, B. pumilus, B. sphaericuset B. subtilis (ATCC 6051) avaient une plus grande résistance à la chaleur – leurs paramètres de traitement optimaux étaient de 80°C pendant 20 minutes. Pour B. cereus spores, 70°C pendant 20 minutes était le traitement thermique optimal.

Cependant, un traitement à 65 °C pendant cinq minutes s’est avéré diminuer considérablement la résistance de B. subtilis (ATCC 19659) spores à 1500 ppm de NaOCl, les auteurs ont donc conclu que le traitement thermique n’est pas approprié pour ces souches.

La pureté des spores de B. sphaericus ont augmenté de près de 20 % lorsqu’ils ont été traités avec du lysozyme à 100 μg/ml et aucune disqualification n’a été observée chez B. pumilus, B. sphaericus ou B. subtilis (ATCC 6051) spores traitées avec du lysozyme à la même concentration. Pour éviter d’altérer la résistance, un traitement au lysozyme aux concentrations de 10 et 1 μg/ml serait optimal pour B. cereus, B. licheniformis et B. subtilis (ATCC 19659) spores, respectivement.

Le traitement par sonication a considérablement amélioré la pureté de B. sphaericus spores de 78,6 à 95,5 pour cent. Après traitement par sonication, aucune disqualification n’a été observée dans tous les tests Bacille spores avec le test de résistance au NaOCl.

Dans l’ensemble, les auteurs ont tiré plusieurs conclusions, notamment que “le milieu de sporulation optimal varie pour différents Bacille souches ; » alors que les traitements par la chaleur, le lysozyme et la sonication peuvent améliorer la pureté des spores de certaines espèces, ils peuvent compromettre la qualité des autres ; et les «périodes de maturation optimales allaient de sept à 21 jours pour Bacille souches ». Les auteurs ont conclu : « Toutes ces découvertes ouvrent la voie à une évaluation plus approfondie de l’activité sporicide des désinfectants contre Bacille spores.

Le document a été publié dans le Journal de microbiologie industrielle et de biotechnologie.

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