Modèle de cellules pulmonaires humaines A549 conçu en laboratoire propice à l’étude des antiviraux SARS-CoV-2

Dans une étude récemment publiée sur le bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont développé un modèle à base de cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 pour sonder la réplication du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans le but de faciliter la découverte d’antiviraux contre le SRAS-CoV-2.

Étudier: Système de modèle de culture cellulaire utilisant des cellules A549 modifiées pour exprimer des niveaux élevés d’ACE2 et de TMPRSS2 pour enquêter sur l’infection par le SRAS-CoV-2 et les antiviraux. Crédit d’image : Microgen/Shutterstock.com

Il existe un besoin critique de découvrir des antiviraux efficaces contre le SRAS-CoV-2 qui pourraient compléter la stratégie de vaccination actuelle pour lutter contre la pandémie en cours causée par ce virus. Pour répondre à ce besoin, la présente étude s’est concentrée sur un modèle basé sur une lignée cellulaire pulmonaire humaine qui pourrait reproduire le cycle de vie du SRAS-CoV-2, être propice à l’étude des interactions virus-hôte et faciliter la découverte de nouveaux médicaments antiviraux.

À propos de l’étude

Le SRAS-CoV-2 utilise l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) dans les cellules hôtes comme récepteur d’entrée et la protéase sérine 2 transmembranaire (TMPRSS2) pour amorcer la protéine de pointe (S). Les chercheurs de la présente étude ont transduit les gènes lentiviraux ACE2 et TMPRSS2 de manière séquentielle dans les cellules A549. Après la sélection de puromycine, ils ont testé plus de 50 clones pour l’infection par le virus SARS-CoV-2.

Le clone parental 43.20 présentait de faibles niveaux d’expression de l’ACE2 mais présentait un taux d’infectiosité d’environ 20 %. En conséquence, les chercheurs ont sélectionné ce clone pour un enrichissement supplémentaire du récepteur ACE2 par tri cellulaire. À cette fin, la population de cellules triées présentant un niveau élevé d’expression de l’ACE2 a été appelée ACE2plus, ce qui était également autorisé pour la réplication du SRAS-CoV-2.

L’équipe a effectué une infection comparative avec l’isolat WA1/2020 et le virus recombinant (icSARS-CoV-2mNG) dans des cellules ACE2plus et Vero E6. Les cellules ACE2plus infectées de type sauvage présentaient des taux d’infection d’environ 60 %, tandis que les cellules Vero E6 présentaient des taux d’infectiosité d’environ 70 %.

Établissement d’un modèle cellulaire ACE2plus hautement permissif pour la réplication du SRAS-CoV-2. (A) Schéma expérimental pour établir A5494320 et A549ACE2/TMPRSS2 (ACE2plus). Infection par le SRAS-CoV-2 observée dans les cellules ACE2plus (B) et 43,20 (C) 48 heures après l’infection. Un anticorps spécifique au Spike a été utilisé pour détecter les cellules infectées ; Des plaques à 96 puits ont été imagées avec ImageXpress, grossissement 4X, barre d’échelle 100 uM. (D) Les images numérisées ont été analysées à l’aide du logiciel MetaXpress pour déterminer l’infectivité (les cellules Spike + ont été normalisées par rapport au nombre total de cellules). Dans la condition 1, 20 000 cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits ; 15 000 cellules ont été ensemencées dans la condition 2. (E) ACE2plus montre une infectiosité comparable aux cellules Vero E6 tout en défiant avec le SARS-CoV-2 (WA1/2020) ou icSARS-CoV2-mNG (WA1/2020). (F, G) Les surnageants contenant des virus provenant de cellules ACE2plus infectées 48 heures après l’infection ont été collectés et analysés par RT-qPCR et test de plaque pour mesurer la charge virale et les particules virales, leur capacité à former des plaques. Les données représentent la moyenne (± SD) de deux expériences indépendantes.

Les niveaux d’acide ribonucléique (ARN) de nucléoprotéine virale ont été quantifiés à l’aide de la transcription inverse quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase (RT-qPCR), pour laquelle les surnageants ont été collectés à partir de cellules traitées avec le virus de type sauvage et icSARS-CoV-2-mNG à 48 heures après l’infection (pi) et traitées pour l’extraction d’ARN.

La fusion cellule-cellule permet aux virus d’infecter les cellules voisines, pour lesquelles le site polybasique S1/S2 du SARS-CoV-2 S est requis, ce qui implique également la formation de syncytium. La taille des syncytia constitue une caractéristique de la pathologie associée à la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19); ainsi, il pourrait être essentiel de comprendre la capacité de formation de syncytium entre les variantes de pointe du SARS-CoV-2.

Pour cela, les chercheurs ont d’abord établi une lignée cellulaire stable mCherry en utilisant le modèle ACE2plusC3. Après tri, plus de 98 % des cellules ont exprimé la protéine mCherry ; par conséquent, ce modèle cellulaire a été utilisé pour observer la cinétique de la fusion cellule-cellule à médiation S sans co-culture avec d’autres cellules. Ensuite, ils ont transfecté une quantité égale de plasmides S indiqués dans des cellules ACE2plusC3-mCherry pendant 24 heures.

Les chercheurs ont également évalué l’efficacité du mésylate de Camostat, de l’EIDD-1931 et du Remdesivir pour inhiber l’infection par le SRAS-CoV-2. Ensuite, ils ont étudié l’efficacité de l’inhibiteur de la furine Decanoyl RVKR-CMK pour déterminer le besoin de furine protéase pour la formation de syncytium dans les cellules ACE2plucC3. Les cellules ont été infectées avec l’isolat WA1/2020 à MOI 0,1, inoculées avec différentes concentrations de Decanoyl-RVKR-CMK pendant 36 heures.

Formation de syncytium médiée par le SRAS-CoV-2-Spike dans les cellules ACE2plusC3. (A) Schéma expérimental pour observer la formation de syncytium. Pour visualiser et capturer des images de puits entiers, une plaque entière de 24 puits a été numérisée (B) Images représentatives de deux expériences indépendantes. Les plasmides SARS-CoV-2 Spike ont été transfectés dans des cellules avec ou sans traitement par inhibiteur de protéase. Après 24 heures, les cellules ont été fixées et numérisées à l’aide d’un cytomètre à image Celigo. Les images mCherry et DAPI ont été fusionnées par Celigo Software. Barre d’échelle 100 uM. L’étoile montre l’aire du syncytium.

Résultats de l’étude

Même pendant une faible multiplicité d’infection (MOI) de 0,05 et 0,1, les cellules ACE2plus ont montré une infectivité plus élevée que les cellules parentales 43,20. La MOI fait référence au nombre de virions ajoutés par cellule pendant l’infection.

Par rapport aux cellules ACE2plus, les cellules Vero E6 ont montré une infectivité 1,75 fois plus élevée lorsqu’elles sont traitées avec un virus de type sauvage et environ 1,2 fois plus infectieux lorsqu’elles sont traitées avec icSARS-CoV-2-mNG. Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré une efficacité comparable des cellules ACE2plus et Vero E6 pour la modélisation des infections par le SRAS-CoV-2.

Les résultats de l’étude ont également démontré que le sous-clone dérivé d’une cellule unique d’ACE2plusC3 était très sensible à l’infection par le SRAS-CoV-2 et présentait des niveaux d’expression d’ARN messager (ARNm) ACE2 et TMPRSS2 plus élevés que les cellules Calu3 utilisées dans le commerce. En outre, les récepteurs ACE2 à la surface des cellules ACE2plusC3 ont été reconnus par la protéine du domaine de liaison au récepteur (RBD) du SARS-CoV-2, soutenant ainsi l’utilisation de ACE2plusC3 pour les tests d’infection lentivirale SARS-CoV-2 257.

Le mésylate de camostat, l’EIDD-1931 et le remdesivir ont présenté de puissants effets antiviraux avec une concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) de 59,98 uM, 0,84 uM et 0,14 uM, respectivement. Ces résultats démontrent que le modèle cellulaire ACE2plucC3 pourrait être utilisé pour l’évaluation de médicaments antiviraux.

Le syncytia multinucléé est une caractéristique clinique courante du COVID-19 sévère induit dans les cellules ACE2plusC3 soit par une infection virale, soit par surexpression des protéines de pointe des variantes du SRAS-CoV-2. Les protéines de pointe des variantes Delta et Beta du SRAS-CoV-2 ont induit la formation de syncytia géants de plus de 300 uM, de cellules agrandies multinucléées, par rapport à WA1/2020 ou alpha S.

La formation de syncytia a été réduite lors de l’ajout d’inhibiteurs de furine protéase, de décanoyl RVKR-CMK ou d’inhibiteurs de Camostat aux cellules transfectées. En outre, la protéine de pointe variante SARS-CoV-2 Omicron a mal induit la fusion cellulaire dans les cellules ACE2plus mCherry, indiquant ainsi que le modèle ACE2plusC2 peut être utilisé pour étudier la fusion cellulaire à médiation S.

Conclusion

La présente étude fournit des données sur la production du SRAS-CoV-2, l’infection pseudotypée, la fusion cellule à cellule à médiation par des pointes et les tests antiviraux pour souligner l’importance du modèle cellulaire à base de poumon humain pour l’étude du SRAS-CoV-2 et de ses variantes en constante évolution.

En particulier, le modèle de cellule A549ACE2PlusC3 est apparu comme un modèle alternatif et amélioré pour in vitro modélisation de la maladie, qui est utile pour la découverte de médicaments COVID-19 et les études d’interaction hôte-viral. Dans l’ensemble, l’étude a montré un modèle cellulaire robuste basé sur des cellules pulmonaires humaines, qui pourrait devenir une ressource précieuse pour la communauté de recherche étudiant le SRAS-CoV-2.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.

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