Génération de vaccins ARNm-LNP codant pour les glycoprotéines d’enveloppe du VHC
Luciférase à codons optimisés et glycoprotéines d’enveloppe du VHC (génotype 1a/H77C) sE1 (aa 193–351), sE2 (aa 386–660) et sE2 modifiéF442NYT séquence spécifique ont été construits. VHC sE2 et sE2F442NYT des échantillons de protéines ont été examinés et comparés pour le site de glycosylation inséré à F442 après traitement PNGaseF à la Washington University Proteomics Shared Resource (WU-PSR), St. Louis. Le site de glycosylation au niveau du résidu F442 de sE2 modifiéF442NYT la protéine a été observée après une désamidation constitutive de ce résidu et une désamidation variable d’autres résidus d’asparagine dans cette séquence. Les ARNm du VHC sE1, sE2 ou sE2F442NYT ont été générés, purifiés et encapsulés dans des LNP pour être utilisés comme vaccins candidats dans cette étude8.
Luciférase à codons optimisés HCV E1193–351 et VHC E2386–660 des séquences spécifiques avec ou sans mutations au niveau des résidus 442 et 444 ont été synthétisées en ARNm, purifiées et encapsulées dans des LNP pour une utilisation dans l’immunisation de souris. Le mélange lipidique éthanolique comprenant le lipide cationique ionisable, la phosphatidylcholine, le cholestérol et le polyéthylèneglycol-lipide a été rapidement mélangé avec une solution aqueuse contenant des ARNm N1-mΨ purifiés sur cellulose transcrits in vitro. Les LNP chargés d’ARNm ont été formulés en utilisant une concentration totale de lipides de 40 mM. Les particules chargées d’ARN ont été caractérisées par la taille, la charge de surface, l’efficacité d’encapsulation et la teneur en endotoxines et ont été stockées à -80 ° C à une concentration d’ARN de 1 μg / μL (dans le cas de particules chargées) et une concentration totale de lipides de 30 μg/μL (particules chargées et vides). Le diamètre hydrodynamique moyen des ARNm-LNP était d’environ 80 nm, avec un indice de polydispersité de 0,02 à 0,06 et une efficacité d’encapsulation d’environ 95 %. La formulation de LNP utilisée dans cette étude est la propriété d’Acuitas Therapeutics (brevet américain 10 221 127). Des aliquotes à usage unique de la préparation vaccinale ont été utilisées pour l’immunisation des souris.
Immunisation de souris avec un vaccin ARNm-LNP et infection de provocation à l’aide d’un virus de la vaccine recombinant
Des souris BALB/c (Jackson Lab) ont été divisées en cinq groupes (5 souris par groupe) et chaque groupe de souris a été immunisé par voie intramusculaire avec 10 μg de vaccin candidat ARNm-LNP comme sE1/sE2, sE1, sE2, sE2F442NYT, sE1/sE2F442NYT, ou contrôle du véhicule deux fois à 2 semaines d’intervalle. La provocation par la vaccination contre le VHC en tant que modèle de substitution est utile pour analyser la réponse protectrice à l’infection de provocation8,20,23,24. Les saignements tests (3 jours avant l’immunisation et 3 jours avant l’infection d’épreuve) des souris ont été analysés. L’utilisation du modèle de provocation virus de la vaccine recombinant (vv)/VHC dans notre étude a examiné la pertinence biologique de la réponse des lymphocytes T, et non de l’anticorps, en tant que fonction de protection contre l’infection de provocation.
Des souris immunisées ont été provoquées par voie intrapéritonéale avec le virus de la vaccine recombinant vivant exprimant le VHC E1-E2-NS2134–966 ou HCVE2-NS2-NS3364–1619 (genotype1a/H77C), et sacrifié 4 jours après l’infection de provocation pour la collecte des ovaires pour une analyse plus approfondie. Les ovaires ont été homogénéisés, congelés-dégelés trois fois et centrifugés. Le surnageant clair a été dilué en série pour mesurer le titre du virus de la vaccine par un essai de formation de plages sur une monocouche de cellules BSC-40. Au bout de 3 jours, les plaques ont été colorées avec du cristal violet à 1 % et comptées.
Déclaration éthique
Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux réglementations locales, étatiques et fédérales pertinentes. Les études ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Saint Louis (IACUC).
Quantification des cytokines
Les saignements de test (3 jours avant l’immunisation et 3 jours avant l’infection d’épreuve) de souris expérimentales ont été analysés. Les cytokines sériques, IL-2 (Sigma, RAB0287), IFN-γ (R&D Systems, DY485), IL-4 (Biolegend, 431101) et IL-10 (Invitrogen, 88–7105–22) ont été mesurées à partir des cellules immunisées souris par ELISA en utilisant des kits disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant et les directives de dilution. De même, l’IL-2 de souris (Sigma, RAB0287), l’IFN-γ (R&D Systems, DY485) et la Granzyme B (R&D Systems, DY1865) ont été quantifiés à partir d’homogénats d’ovaires de souris après infection par le virus recombinant de la vaccine.
Test de neutralisation des pseudoparticules du VHC
Des pseudo-particules de VHC (VHCpp) ont été générées par co-transfection de cellules HEK293T avec le vecteur d’emballage HDM-Hgpm2-pRC-CMV-Rev1b-HDM-tat1b, le plasmide Luciférase-IRES-ZsGreen (Ressources BEI) et des plasmides exprimant E1E2 du VHC. génotypes 1a (H77C), 1b (1b58), 3 (3.1.2) et 4(4.1.2) disponibles dans notre laboratoire ou obtenus auprès de Justin Bailey (Johns Hopkins University School of Medicine, MD, USA) en utilisant Lipofectamine 3000 ( Invitrogen L3000–008)23. Les surnageants contenant le HCVpp ont été récoltés 72 h après la transfection et filtrés à travers une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm de pore. Pour les tests de neutralisation du VHCpp, 1,5 × 104 Les cellules Huh7.5 par puits ont été étalées dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits et incubées pendant une nuit à 37 ° C. Le jour suivant, les HCVpp ont été mélangés avec ou sans différentes dilutions en série (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:2400, 1:3200) des sérums de souris immunisées et incubés pendant 1 h à 37 oC avant d’ajouter aux cellules Huh7.5. Après 72 h à 37 ° C, les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse cellulaire (EI53A, Promega) et 100 μl de substrat de luciférase (EI51A, Promega) ont été ajoutés à chaque puits. L’activité de la luciférase a été mesurée en unités de luminescence relative (RLU) à l’aide du luminomètre Glomax (Promega). La concentration inhibitrice de neutralisation de l’infectiosité du pseudotype (IC50) a été définie comme une réduction ≥ 50 % de l’activité de la luciférase en utilisant la formule suivante6. Le pourcentage de neutralisation a été calculé comme[1 − (RLUmAb/RLUuntreated)]× 100, avec les valeurs RLU témoins non traitées moyennées à partir de trois exemplaires. Les activités neutralisantes ont été présentées avec des dilutions des échantillons de sérum en utilisant des limites inférieures et supérieures (0 % et 100 % d’inhibition).
Réponse d’immunoglobuline spécifique à une sous-classe ou à un isotype
Les plaques Nunc MaxiSorp ELISA ont été recouvertes de 1 µg/ml de protéines E1E2 du VHC purifiées (Chiron) dans 50 µl de tampon bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 7,2) pendant une nuit à 4 °C. Les puits ont été bloqués avec un tampon de blocage BSA/PBS à 2,5 % pendant 2 h à 37 °C et lavés quatre fois avec du Tween 20 à 0,01 % dans du PBS. Les sérums de souris ont été dilués en série (1:50, 1:100, 1:200) dans un tampon de blocage, ajoutés à la plaque et incubés pendant une nuit à 4°C, puis lavés. Différentes immunoglobulines anti-souris de lapin marquées HRP (sous-classe : IgG, IgM, IgA ; et isotype : IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) (Bio-Rad, Mouse Typer Isotyping Panel, 1722055) ont été ajoutées aux puits appropriés et incubées pendant 1 h à 37 °C, suivi de quatre lavages. Le conjugué HRP a été ajouté à 1:3000 et incubé pendant 1 h, et le cycle de lavage a été répété. Ensuite, 100 μl de solution de substrat de peroxydase ont été ajoutés et la réaction a été stoppée avec de l’acide sulfurique 2M. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de plaque ELISA (Tecan).
Réactivité spécifique du peptide d’enveloppe du VHC
La liaison des IgG sériques spécifiques aux peptides a été testée par ELISA avec des peptides 18-mer de E1 (aa 314–331), E2 (aa 404–421) et E2 (aa 429–446) de la souche HCV H77 (NR4062 et NR4063, BEI Resources ) représentant divers épitopes neutralisants conservés spécifiques à un génotype9,10,12,13,14,15. Un peptide du domaine de fusion SARS-CoV-2 a été utilisé comme contrôle non pertinent. Les puits ont été recouverts de 500 ng de peptide et ELISA a été réalisé en utilisant différentes dilutions (1:200, 1:400, 1:800) de sérums de souris immunisées comme décrit ci-dessus.
analyses statistiques
Toutes les données ont été analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7. L’analyse des données avec seulement deux groupes a été réalisée à l’aide d’un test Mann-Whitney U unilatéral ou non apparié t-test. Une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Kruskal-Wallis a été utilisée pour de multiples comparaisons par paires entre les groupes. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SD (écart type de la moyenne), et p< 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.
Résumé des rapports
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.
