Virus, inoculation de souris et conception expérimentale
Des souris C57BL/6 de type sauvage (Jackson Laboratory, B6.129P2-tm1Lau/J) ont été obtenues auprès de Jackson Laboratory et des souris NOS2-/- (Jackson Laboratory, B6.129P2-tm1Lau/J, Stock No. 002609) [26] ont été obtenus auprès de l’Animal Facility du National Center of Cell Science Pune, Inde. Les souris NOS2-/- n’ont montré aucune différence pathologique inhérente aux souris WT (Fichier supplémentaire 1 : Fig S4 et S5). Des souris mâles WT et NOS2-/- exemptes de MHV âgées de cinq semaines ont été infectées par RSA59, une souche recombinante isogénique du virus de l’hépatite démyélinisante de la souris ; MHV-A59, décrit précédemment [27]. Les souris ont été inoculées par voie intracrânienne avec RSA59 à 20 000 (50 % de la dose létale à 50 %, DL50) et 10 000 PFU. L’exigence d’une dose de 10 000 PFU était due à la faible survie des souris NOS2-/- infectées par 20 000 PFU de RSA59. Des contrôles infectés fictifs ont été inoculés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) plus 0,75 % d’albumine de sérum bovin (BSA).
Les souris ont été surveillées quotidiennement après l’infection pour détecter les signes et symptômes de la maladie, et des changements de leur poids ont été notés. La sévérité clinique de la maladie a été classée à l’aide de l’échelle suivante : 0 : aucun symptôme de la maladie ; 0,5 : fourrure ébouriffée ; 1 : dos voûté avec ataxie légère ; 1,5 : dos voûté avec ataxie légère et faiblesse des membres postérieurs ; 2 : ataxie, troubles de l’équilibre et/ou paralysie partielle ; 2,5 : une jambe complètement paralysée, problèmes de motilité mais encore capable de se déplacer avec difficulté ; 3 : voûte/émaciation/paralysie graves des deux membres postérieurs et mobilité gravement compromise ; 3,5 : détresse sévère, paralysie complète et moribond ; 4 : mort. Pour les études d’ARN, les souris ont été sacrifiées au jour 6 (phase aiguë), au jour 10 (phase de transition aiguë-adaptative), au jour 15 (phase adaptative chronique) et au jour 30 pi (phase chronique). Pour les analyses histopathologiques, immunohistochimiques, l’estimation du titre viral et les expériences de cytométrie en flux, les souris ont été sacrifiées au jour 9/10 pi (phase chronique adaptative aiguë) et au jour 30 pi (phase chronique).
Estimation de la réplication virale
Des souris WT et NOS2-/- infectées par RSA59 à 10 000 PFU et 20 000 PFU ont été sacrifiées au jour 9/10 pi. Les cerveaux ont été récoltés et placés dans 1 ml de solution saline isotonique contenant 0, 167% de gélatine (gel salin). Les tissus cérébraux ont été pesés et conservés congelés à – 80 ° C jusqu’à ce qu’ils soient titrés. Les tissus ont ensuite été homogénéisés et en utilisant le surnageant, les titres viraux ont été quantifiés par un protocole standard d’analyse de plaque sur des monocouches serrées de cellules L2 comme décrit précédemment. [27] en utilisant la formule : unités formant plaque (PFU) = (nombre de plaques × facteur de dilution/ml/gramme de tissu) et exprimé en log10 PFU/gramme de tissu.
Analyse par cytométrie en flux
Les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec 20 ml de PBS, et les demi-cerveaux ont été homogénéisés dans 2 ml de RPMI contenant 25 mM d’HEPES (pH 7,2), en utilisant des homogénéisateurs de tissus Tenbroeck. L’homogénat de tissu a ensuite été centrifugé à 450 g pendant 10 min. Les culots cellulaires obtenus ont été remis en suspension dans du RPMI contenant de l’HEPES 25 mM, ajustés à 30 % de Percoll (Sigma) et recouverts de 1 ml de Percoll à 70 %. Un deuxième cycle de centrifugation a été appliqué à 800 g pendant 30 min à 4 ° C, après quoi les cellules ont été récupérées de l’interface 30–70%, lavées avec du RPMI et mises en suspension dans du tampon FACS (albumine de sérum bovin à 0,5% dans du PBS de Dulbecco) . Des types de cellules spécifiques ont été identifiés par coloration avec des fluorochromes comme l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la phycoérythrine [(PE), (PECy7)]protéine péridinine chlorophylle [(PerCP), (PerCpCy5.5)]allophycocyanine [(APC), (APCCy7)] et colorants excitables violets [(V450), (V500)] AcM conjugué pendant 45 min sur de la glace dans du tampon FACS. L’expression des marqueurs de surface a été caractérisée avec des AcM (tous de BD Biosciences sauf indication contraire) spécifiques de CD45 (clone Ly-5), CD11b (clone M1/70), CD11c (clone HL3), CD3 (clone 145-2C11), CD4 (clone GK1.5), CD8 (clone 53–6.7), NK1.1 (clone PK136), CD25 (clone PC61) et Foxp3 (clone G155-178). Une coloration intra-nucléaire a été réalisée pour Foxp3 après fixation et perméabilisation (BD 562574) conformément aux directives du fabricant.
Pour détecter l’expression de NOS2 dans les sous-ensembles de cellules immunitaires, une coloration intracellulaire de NOS2 a été réalisée après la coloration des marqueurs de surface comme mentionné ci-dessus. Les cellules ont été fixées et perméabilisées (BD 554714) conformément aux directives du fabricant et colorées avec un anticorps anti-NOS2 (Invitrogen PA3-030A), suivies d’un lavage et d’une coloration ultérieure avec un anticorps secondaire (GαR APC).
Les échantillons ont été acquis sur un cytomètre en flux BD FACVerse (BD Biosciences) et analysés sur le logiciel FlowJo 10 (Treestar, Inc., Ashland, OR) [25]. Tout d’abord, une exclusion de doublet utilisant FSC-A et FSC-W a été effectuée, puis les cellules ont été fermées en fonction de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC) pour se concentrer sur les cellules vivantes. De plus, les cellules ont été analysées pour différencier les populations myéloïdes et lymphoïdes. Les cellules myéloïdes ont été déclenchées à partir d’un déclenchement primaire sur CD45, et un déclenchement CD3 indépendant ou un déclenchement CD3 en plus du CD45 a été appliqué pour les populations lymphoïdes. Des couleurs uniques et des FMO ont été utilisés dans toutes les expériences. Les perles ont été sélectionnées en fonction de leur motif FSC/SSC.
Analyse histopathologique et immunohistochimique
Les souris ont été sacrifiées au jour 9/10 et au jour 30 pi Après perfusion transcardiale avec du PBS et post-fixation avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 26 à 48 h, les tissus de la moelle épinière ont été récoltés et inclus dans de la paraffine. Pour cela, des sections des régions cervicale, lombaire et thoracique de la moelle épinière d’un échantillon biologique ont été intégrées dans un seul moule et sectionnées en sections transversales de 5 μm d’épaisseur à l’aide du système de sectionnement Thermo Scientific HM 355 S. Les coupes ont ensuite été préparées et colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour analyse histopathologique. Une coloration au bleu rapide Luxol (LFB) a été réalisée pour évaluer la démyélinisation dans les tissus de la moelle épinière, comme décrit précédemment avec des modifications mineures [23]. L’immunohistochimie a été réalisée dans la section de la moelle épinière en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine de liaison au calcium spécifique de MG/Mφ ; Molécule 1 d’adaptateur de liaison au calcium ionisé (Iba1) (Wako; n° de catalogue 019-19 741) en dilution 1:600. Les anticorps primaires liés ont été détectés par une technique d’immunoperoxydase avidine-biotine (Vector Laboratories) utilisant la 3,3-diaminobenzidine (DAB) comme substrat [28]. Des lames de contrôle provenant de souris infectées fictives ont été colorées en parallèle. Toutes les lames ont été codées et lues en aveugle.
Quantification des coupes histopathologiques
L’analyse d’image a été effectuée à l’aide de l’application de seuillage densitométrique de base de Fidji (Image J, NIH Image et Scion Image) comme décrit précédemment [29]. En bref, l’analyse d’image pour les sections colorées Iba1 a été réalisée en capturant les images au × 4 pour le cerveau et au × 10 pour la moelle épinière afin que la section entière (c’est-à-dire la zone de numérisation) puisse être visualisée dans un seul cadre. L’image RVB a été déconvoluée en trois couleurs différentes pour séparer et soustraire la coloration spécifique au DAB de la coloration d’hématoxyline de fond. Le périmètre de chaque tissu de la moelle épinière a été délimité numériquement et la surface a été calculée en micromètres carrés. Une valeur seuil a été fixée pour chaque image afin de s’assurer que toutes les cellules marquées par des anticorps étaient prises en considération. Les quantités de coloration Iba1 ont été appelées le pourcentage de surface de coloration qui a été calculée pour chaque section disponible par moelle épinière et tracée.
Pour déterminer la zone de démyélinisation, des coupes transversales de moelle épinière colorées au LFB de chaque souris ont été choisies et analysées à l’aide de Fidji (Image J, NIH Image et Scion Image) [29, 30]. Le périmètre total des régions de substance blanche dans chaque section transversale a été marqué et la surface a été calculée en additionnant les zones de substance blanche dorsale, ventrale et antérieure dans chaque section. En outre, la surface totale des régions démyélinisées a été décrite et rassemblée pour chaque section séparément. Le pourcentage de démyélinisation de la moelle épinière par section et par souris a été calculé pour toutes les sections disponibles.
Isolement d’ARN, transcription inverse et PCR quantitative
L’ARN a été extrait des tissus cérébraux de souris WT et NOS2-/- infectées par RSA59 et de souris infectées fictives à l’aide du protocole d’isolement TRIzol après perfusion transcardiaque avec du PBS traité au diéthylpyrocarbonate (DEPC). La concentration totale d’ARN a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop ND-2000. Un microgramme d’ARN a été utilisé pour préparer l’ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité (Applied Biosystems). L’analyse PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l’aide d’un kit DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR (Thermo Scientific) dans un système de PCR en temps réel Step One Plus (Thermo Fisher Scientific) dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 7 min, 40 cycles de 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s et analyse de la courbe de fusion à 60 °C pendant 30 s. Les réactions ont été effectuées en double ou en triple. Les séquences des amorces utilisées sont données dans le tableau 1. La quantification absolue a été obtenue en utilisant la méthode du seuil (ΔCT). Les niveaux d’expression de l’ARNm des gènes cibles chez les souris WT et NOS2-/- infectées par RSA59 et fictives ont été normalisés avec GAPDH. La moyenne des répliques pour chaque échantillon biologique de souris a été exprimée sous forme d’expression d’ARNm pour décrire les changements entre les groupes infectés WT et NOS2-/- ainsi qu’entre les groupes WT infectés fictifs et NOS2-/-, le cas échéant.
Microscopie par immunofluorescence
Les souris WT et NOS2-/- infectées ont été sacrifiées au jour 9/10 pi et au jour 30 pi et des coupes de tissu de moelle épinière ont été récoltées, traitées et incluses dans de la paraffine. Des coupes transversales de 5 μm d’épaisseur de moelle épinière ont été utilisées pour effectuer une imagerie par immunofluorescence. Les coupes de tissus parallèles à celles utilisées pour l’histopathologie correspondante ont été colorées. En bref, les lames ont été déparaffinées suivies d’une réhydratation et d’un démasquage de l’antigène. Les lames ont ensuite été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,2 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en secouant l’incubation à température ambiante pendant 15 min et bloquées à l’aide d’albumine de sérum bovin à 1 % (BSA) préparée dans une solution de PBS à 0,2 % de Triton X-100-1X. à 37°C pendant 1h. Cela a été suivi d’une incubation sous agitation à 4 ° C pendant 16 h avec des anticorps primaires préparés dans une solution de blocage. Chaque section de chaque lame d’échantillon a été colorée séparément pour les combinaisons suivantes : i) Anti-Iba1 (1 : 500, Wako ; n° de catalogue 019-19 741) et anticorps sérique maison anti-MBP (1 : 1) ; ii) Anti-Iba1 (1:500) et anticorps sérique maison contre PLP (1:1). Les lames ont ensuite été lavées et incubées pendant 1 h à 37 ° C avec une combinaison d’anticorps secondaires AlexaFluor568 et AlexaFluor488 (1: 750 chacun) préparés dans une solution de blocage. Enfin, les lames ont été lavées dans du PBS et montées à l’aide de Vectashield avec DAPI.
Les images d’épifluorescence ont été acquises à l’aide d’un scanner de diapositives virtuel Olympus (VS200) et traitées à l’aide du logiciel OlyVIA. L’imagerie confocale a été réalisée à l’aide du microscope confocal Zeiss (LSM710) et les images ont été traitées avec le logiciel Zen 2010.
analyses statistiques
Les valeurs ont été représentées sous forme de valeurs moyennes ± erreurs standard de la moyenne (SEM). Les valeurs ont été soumises à des tests t de Student non appariés avec correction de Welch ou Kruskal-Wallis One-Way ANOVA ou Ordinary One-Way ANOVA ou Two-Way ANOVA avec tests de comparaison multiples (test de Tukey et test de Holm-Sidak) pour calculer la signification de différences entre les moyens. Le test du log-rank (Mantel-Cox) a été utilisé pour calculer la signification statistique de la mortalité entre les groupes. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de GraphPad Prism 8 (La Jolla, CA). UN P-la valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
