Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par les hybridomes

Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par les hybridomes

Carte génomique et séquence annotée de paires de bases des domaines constants rIgG2a. La localisation génomique (A) et la séquence annulée de la paire de base (B) et du locus IgH de l'IgG2a de rat situé sur le chromosome 6 (Rn celera, AC_0000741) sont indiquées. Les exons de CH1, Hinge, CH2 et CH3 sont indiqués (sur fond gris) avec les sites accepteur d'épissage et donneur (souligné, cursif). Les motifs protospacer adjacents (PAM) ciblés pour l'ARNg-H (jaune souligné) et l'ARNg-ISO (rouge souligné) sont indiqués. Crédit: Science Advances, doi: 10.1126 / sciadv.aaw1822

Les bioingénieurs et les scientifiques de la vie intègrent technologie d'hybridome produire un grand nombre d'anticorps identiques et développer de nouveaux traitements et diagnostics d'anticorps. Des études précliniques et cliniques récentes sur la technologie soulignent l’importance des isotypes d’anticorps pour l’efficacité thérapeutique. Dans une nouvelle étude, une équipe de chercheurs aux Pays-Bas a mis au point un système polyvalent de répétitions de palindromes courts régulièrement regroupés (CRISPR) polyvalent et varié et de réparations dirigées par homologie (HDR) plate-forme pour l'ingénierie rapide immunoglobine domaines et forment des hybridomes recombinants qui sécrètent des anticorps de concepteur d’un format, d’une espèce ou isotype. Dans cette étude, Johan M. van der Schoot et ses collègues des départements interdisciplinaires d'immunologie, de protéomique, d'immunohématologie, d'immunologie translationnelle et d'oncologie médicale ont utilisé la plateforme pour former des hybridomes, des chimères et des mutants recombinants. Les produits anticorps stables ont conservé leur spécificité antigénique. L'équipe de recherche pense que la plate-forme polyvalente facilitera l'ingénierie d'anticorps à grande échelle pour la communauté scientifique afin de renforcer la recherche sur les anticorps précliniques. Le travail est maintenant publié sur Progrès de la science.

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont révolutionné le domaine médical avec des applications pour traiter des maladies qui étaient autrefois considérées incurables. La technologie des hybridomes est largement utilisée depuis 1975 pour la découverte, le criblage et la production d’AcM, en tant que lignées cellulaires immortelles pouvant produire de grandes quantités d’AcM pour de nouveaux traitements à base d’anticorps. Les scientifiques ont généré, validé et facilité un grand nombre d'hybridomes au cours de la dernière décennie pour la recherche préclinique, où le format de l'AcM et les isotypes étaient importants pour comprendre leurs performances dans les modèles précliniques. Les Acm génétiquement modifiés sont généralement produits avec technologie recombinante, où les domaines variables doivent être séquencés, clonés dans plasmides et exprimé dans des systèmes transitoires. Ces processus prennent du temps, sont difficiles et coûteux, et conduisent à la sous-traitance de sociétés de recherche sous contrat, ce qui entrave le processus de développement académique à un stade précoce des anticorps et de recherche préclinique.

Dans son mécanisme d’action, les domaines d’anticorps constants formant le fragment du domaine cristallisable – (Fc) sont essentiels au processus. efficacité thérapeutique des mAb puisqu'ils coopèrent avec des récepteurs Fc spécifiques (FcR). Les travaux de recherche précédents avaient mis en évidence le rôle central de Fc dans les thérapies à base d’anticorps pour souligner ce rôle. Depuis son apparition, la cible CRISPR et la protéine associée Cas-9 (CRISPR-Cas9) technologie d'édition du génome a ouvert une multitude d'opportunités intéressantes pour la thérapie génique, l'immunothérapie et la bio-ingénierie. Les chercheurs ont utilisé CRISPR-Cas9 pour moduler l'expression des mAb dans les hybridomes, générer un plateforme d'hybridome et ingénieur hybridomes à introduire modification d'anticorps. Cependant, une plate-forme pour la substitution polyvalente et efficace du Fc par des espèces étrangères au sein d'hybridomes à domaines constants reste à modifier génétiquement.

Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par les hybridomes

Ingénierie CRISPR / HDR de l’hybridome NLDC145 afin d’obtenir des fragments Fab 'pouvant être triés contre DEC205. (A) Représentation schématique de l'approche CRISPR / HDR pour la conversion d'hybridomes de type sauvage (WT) en lignées cellulaires produisant un fragment Fab '. (B) Le locus IgH ciblé de NLDC-145 avec la région variable (VH) et les régions constantes (CH1, Hinge, CH2 et CH3) annotées est présenté. Cas9 est guidé par l'ARNg-H vers la région charnière et crée une rupture à double brin avant la première cystéine. La fracture à double brin est ensuite réparée par HDR via la construction du donneur consistant en un sortag et son motif d'étiquette (srt-his), un site d'entrée ribosomique interne (IRES), un gène de résistance à la blasticidine (Bsr), un signal de terminaison de transcription polyA (pA) et d'homologie (5 'HA et 3' HA). Les 10 premiers acides aminés de la charnière avant et après la réussite de CRISPR / HDR sont indiqués. (C) Trois jours après l'électroporation, une PCR a été réalisée sur l'ADN génomique de la population ciblée WT et CRISPR / HDR en utilisant les amorces 1 et 2 (B). Le gel d’agarose présente un amplicon de taille attendue exclusivement pour la population ciblée par CRISPR / HDR, ce qui indique une intégration correcte du construit du donneur dans la population. (D) Après la dilution limite des cellules ciblées par CRISPR / HDR, une analyse par cytométrie en flux a été effectuée sur le surnageant de suspensions de cellules monoclonales. À cette fin, des cellules exprimant DEC205 (JAWSII) ont été incubées avec des surnageants clonaux en combinaison avec des anticorps secondaires dirigés contre his-tag (bleu) ou rIgG2a (rouge). Le signal exclusif his-tag indique la production de fragments Fab '. (E) L'immunotransfert du surnageant des clones 47 à 52 pour les chaînes his-tag (bleu) et lourde et légère (rouge) de rat confirme les résultats de cytométrie en flux. (F) Dans le test de compétition, les JAWSII ont été incubées avec une dilution en série (150 à 20 ng / ml) de Fab'DEC205srt (bleu) purifié (bleu), d'αDEC205 mAb (rouge) ou d'un témoin d'isotype (gris) en combinaison avec un marqueur fluorescent αDEC205 mAb (1 µg / ml). La diminution de l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) est liée à l'augmentation de la concurrence pour la liaison de DEC205 avec l'AcDEC205 marqué par fluorescence. n = 3, moyenne ± SEM. (G) Fab′DEC205srt peut être fonctionnalisé en position C-terminale avec une sonde marquée par fluorescence (GGGCK (FAM)) en utilisant une ligature à médiation par une sortase (3M srt). LC, chaîne légère. Crédit: Science Advances, doi: 10.1126 / sciadv.aaw1822

Dans le présent travail, van der Schoot et al. Hybridomes génétiquement modifiés utilisant une réparation CRISPR / dirigée par homologie en une étape. Ils ont rapidement généré les hybridomes recombinants pour sécréter des mAb au format Fc choisi, avec la liberté d'installer les étiquettes préférées ou les mutations d'insertion. L’équipe de recherche a formé des hybridomes qui ont produit fragment de liaison à l'antigène (Fab '), c'est-à-dire un site d'anticorps qui se lie généralement à des antigènes, C-terminal équipé d'étiquettes pour la modification et la purification chimioenzymatique spécifiques à un site. Ils ont généré des hybridomes pour sécréter des anticorps chimériques avec l'isotype et l'espèce de choix et former des anticorps mutants Fc sans compromettre la spécificité de l'antigène. Ils ont facilement isolé les anticorps modifiés du surnageant d'hybridome pour observer le caractère biochimique et immunologique attendu in vitro et in vivo. Étant donné que l'équipe de recherche ciblait des domaines constants du locus d'immunoglobuline, la méthode CRISPR / HDR pourrait être adaptée à des hybridomes de toute espèce ou isotype. La nouvelle méthode polyvalente d'ingénierie des anticorps renforcera la recherche sur les anticorps précliniques pour la communauté scientifique.

Les fragments Fab 'ont déjà été utilisés pour traiter des maladies auto-immunes, cible différentes charges utiles en nanomédecine thérapeutique et générer anticorps bispécifiques. Au cours de la technique conventionnelle d’obtention de fragments Fab ', les scientifiques n’ont pas pu installer d’étiquettes ni de mutations utiles sur le génome. Pour obtenir des hybridomes Fab 'sécrétant à l'aide de CRISPR / HDR dans le présent travail, l'équipe de recherche a sélectionné le clone d'hybridome NLDC-145 en tant que première cible, qui sécrétait les mAbs d'intérêt spécifiques. Pour cibler le locus de la chaîne lourde du clone, van der Schoot et al. a utilisé un ARN guide optimisé pour diriger la protéine Cas9 vers la région d’intérêt de la charnière et créer une rupture à double brin. Pour réparer la coupure double brin, ils ont conçu une construction HDR et inséré des étiquettes d’intérêt. Depuis le l'efficacité du HDR est généralement faible, l’équipe a enrichi le support de cellules contenant la construction du donneur pour la compétence. Ils ont ensuite identifié l’inclusion de la construction du donneur à l’aide du réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour confirmer l'intégration des constructions de donneur dans l'emplacement génomique correct.

Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par les hybridomes

Ingénierie CRISPR / HDR de l’hybridome MIH5 pour obtenir un panel de variants d’isotype. (A) Stratégie CRISPR / HDR pour mettre au point des hybridomes rIgG2a et obtenir des hybridomes recombinants sécrétant des isotypes murins. (B) Le locus IgH ciblé de MIH5 avec la région variable (VH), la région constante 1 (CH1) et la charnière annotée. Cas9 est guidé par l'ARNg-ISO vers la région intronique en amont de CH1. La rupture bicaténaire résultante est ensuite résolue via HDR via une construction donneur, ce qui conduit à une insertion dans le cadre d'un accepteur d'épissure (SA, gris), d'un isotype de choix (jaune), d'un sortag et de son motif d'étiquette (srt- his, blue), un IRES, un gène de résistance à la blasticidine (Bsr) et un signal de terminaison de la transcription polyA (pA) en amont de la CH1 native. L'insert est enfermé par des bras d'homologie (5 'HA et 3' HA). (C) Trois jours après l'électroporation, un ADN provenant de populations de MIH5 ciblées par CRISPR / HDR est obtenu pour une PCR avec l'amorce 3 et l'amorce 2 (B). Le gel d'agarose du produit de PCR révèle des amplicons de la taille correcte exclusivement pour les populations ciblées par CRISPR / HDR. (D) Après avoir sélectionné un hybridome monoclonal pour chaque isotype, le surnageant de chaque clone modifié par isotype a été incubé avec des cellules cibles exprimant PD-L1 (CT26). Les graphes affichés démontrent que les surnageants contiennent exclusivement la variante d'isotype modifiée avec un his-tag C-terminal, alors que les mAb rIgG2a d'origine sont absents. Les variants d'isotype MIH5 (E) purifiés ont été marqués efficacement avec la sonde fluorescente GGGCK (FAM) en utilisant une ligature médiée par une sortase. Crédit: Science Advances, doi: 10.1126 / sciadv.aaw1822

Après une semaine, ils ont obtenu des suspensions de cellules monoclonales et ont utilisé le surnageant pour déterminer la spécificité antigénique et le phénotype du produit sécrété. En utilisant cytométrie en flux, ils ont observé le succès du génie génétique d’une grande partie des hybridomes monoclonaux et ont validé les résultats avec Western blot analyse pour identifier les produits anticorps / protéines d'intérêt. Après avoir formé avec succès les hybridomes recombinants pour produire le Fab 'd'intérêt, van der Schoot et al. ont utilisé la même stratégie pour développer d’autres hybridomes d’intérêt dans le domaine de l’immuno-oncologie. Ils n'ont pas observé de baisse de la production d'anticorps utilisant les hybridomes CRISPR / HDR-machinés pendant une longue période (1 à 3 ans).

Encouragée par le succès de la stratégie CRISPR / HDR en une étape pour générer des hybridomes de Fab ', l'équipe a continué à étendre la plate-forme en développant des hybridomes pour sécréter diverses variantes de Fc du même anticorps. Pour preuve de concept, ils ont conçu un piège à gènes CRISPR / HDR approche de frappe et l'a testé par génie génétique à l'aide d'un hybridome MIH5 pour produire des anticorps chimériques. Ils ont inclus un isotype mutant avec des substitutions d'acides aminés, dont ils ont évalué l'intégration par imbrication sur cible à l'aide d'une PCR génomique et ont vérifié la présence du produit de PCR attendu. L’équipe de recherche a effectué une analyse Western Blot de la substance purifiée anticorps chimérique des produits pour confirmer la substitution de la chaîne lourde du rat natif via une chaîne lourde de souris introduite génétiquement, au niveau des protéines. Ils ont montré que la modification de l'isotype observée avec CRISPR / HDR n'était pas simplement limitée aux hybridomes MIH5.

Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par les hybridomes

Engagement FcyR des variants de l'isotype MIH5. Les sensogrammes représentatifs (A) affichent les interactions des anticorps monoclonaux MIH5 WT (type sauvage) et de MIH5 (mIgG1, mIgG2a, mIgG2b, mIgA et mIgG2asilent) immobilisés à des concentrations croissantes. La liaison à FcyR est exprimée en unités de résonance (RU). La RPS a été réalisée sur quatre concentrations différentes de FcyR immobilisés (1, 3, 10 et 30 nM) afin de déterminer l'affinité (Kd (M)) des variants de Fc pour les différents FcR (B). n = 3, moyenne ± SEM. (C) Activité de cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC) prévue pour chaque variant d'isotype murin sur la base de leur affinité différentielle pour les FcyR. Crédit: Science Advances, doi: 10.1126 / sciadv.aaw1822

Après avoir établi et validé l'approche d'ingénierie génomique CRISPR / HDR d'hybridome, l'équipe a caractérisé les propriétés fonctionnelles ou biologiques des AcM à commutation d'isotype. Pour cela, ils ont effectué des mesures pour déterminer les interactions anticorps-récepteur. D'après la capacité observée d'activer et d'inhiber les récepteurs, van der Schoot et al. prédit la capacité des AcM modifiés par CRISPR à évoquer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps dans les études précédentes. Pour compléter l’étude de caractérisation, l’équipe de recherche a testé le potentiel des anticorps à induire une toxicité cellulaire dépendante des anticorps in vitro et in vivo.

Pour des expériences en laboratoire, ils ont utilisé des cellules d'adénocarcinome du côlon murines (MC38) opsonisé pour faciliter la phagocytose / absorption de la particule, avec les variants MIH Fc pour interagir avec le sang total. Pour des expériences in vivo, ils ont testé la capacité des variants de MIH Fc à épuiser Cellules B (qui produisent des immunoglobines). Après la procédure expérimentale, l’équipe de recherche a euthanasié les souris et isolé leur rate pour déterminer l’appauvrissement en lymphocytes B par cytométrie en flux et immunofluorescence imagerie. Les tests in vivo et in vitro ont fourni des résultats similaires. Ensemble, les travaux ont montré que les AcM chimériques et mutants élaborés à l'aide des technologies CRISPR / HDR présentaient les mêmes caractéristiques biochimiques et de facteurs immunitaires que leurs homologues natifs et recombinants.

Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par les hybridomes

Fonction d'effecteur des variants d'isotype MIH5. ADCC (A) pour comparer la fonction effectrice des variants d’isotype MIH5. Les cellules MC38 ont été marquées au 51Cr, opsonisées avec différents variants d'isotype MIH5 et exposées au sang total de souris C57BL / 6 pendant 4 heures. La lyse spécifique a été quantifiée en mesurant la libération de 51Cr. n = 3, moyenne ± SEM. * P <0,05. (B) Configuration expérimentale du test de déplétion in vivo. Les cellules B spléniques marquées avec les colorants traceur Violet et Rouge ont été utilisées comme cellules cibles pour la déplétion in vivo. Les cellules B violettes ont été opsonisées avec le variant mIgG2asilent, tandis que les hématies B ont été opsonisées avec le variant mIgG2a, mIgG2b ou mIgA. Par la suite, les cellules B ont été mélangées dans le rapport 1: 1 (graphique et diagramme du haut) et injectées par voie intraveineuse à des souris C57BL / 6. Vingt-quatre heures plus tard, les rates ont été isolées et les rapports entre les lymphocytes B violets et rouges ont été déterminés par cytométrie en flux (tracé du bas et diagramme). Les ratios avant injection et après isolement de la rate ont été utilisés pour quantifier la déplétion spécifique de l'isotype des cellules cibles. (C) Expérience représentative indiquant une déplétion spécifique de mIgG2a, mIgG2b et mIgA de cellules cibles avec des cellules opsonisées mIgG2asilentes comme population de référence. n = 3, moyenne ± SEM. * P <0,05. Crédit: Science Advances, doi: 10.1126 / sciadv.aaw1822.

De cette façon, Johan M.S. van der Schoot et ses collaborateurs ont développé une plate-forme polyvalente pour la génération facile et rapide d'anticorps modifiés par Fc, à partir de leurs hybridomes parent. Ils ont utilisé avec succès une approche CRISPR / HDR en une étape pour obtenir des hybridomes, produisant ainsi (1) des fragments Fab 'monovalents, (2) des variants d'isotype Fc d'une espèce étrangère ou (3) des mutants Fc-silencieux sans fonction effectrice – dans les 21 jours. . Le procédé comprenait des étiquettes de protéines utiles pour la purification et la conjugaison spécifique à un site. La technique est accessible à tout laboratoire capable de cultiver une lignée cellulaire d'hybridome.

Le processus fournit une boîte à outils moléculaire pour réutiliser la richesse des lignées de cellules d'hybridome établies. La plate-forme universelle CRISPR / HDR mise au point dans le cadre de ce travail avait un taux de réussite de 100%; où chaque expérience d'ingénierie génomique utilisant une seule construction HDR spécifique a abouti à plusieurs clones d'hybridomes correctement développés. Étant donné que les produits d'hybridome sont largement utilisés dans les études précliniques in vivo, cette méthode renforcera la recherche clinique sur les anticorps pour le développement d'anticorps thérapeutiques. La fonctionnalisation spécifique à un site de produits d'anticorps artificiels aura de nombreuses applications dans les domaines du génie biomédical, de la biologie chimique, du développement de médicaments et de la nanomédecine, comme applicable à l'ensemble de la communauté scientifique.


Ingénierie des cellules B pour exprimer des anticorps spécifiques de l'agent pathogène afin de les protéger contre l'infection


Plus d'information:
Johan M. van der Schoot et al. Diversification fonctionnelle des anticorps produits par les hybridomes par génie génomique CRISPR / HDR, Progrès de la science (2019). DOI: 10.1126 / sciadv.aaw1822

Hélène Kaplon et al. Anticorps à surveiller en 2018, mAbs (2018). DOI: 10.1080 / 19420862.2018.1415671

G. KÖHLER et al. Cultures continues de cellules fusionnées sécrétant des anticorps de spécificité prédéfinie, La nature (2005). DOI: 10.1038 / 256495a0

M. Jinek et al. Endonucléase ADN Guidée Par Un Double ARN Programmable Dans L'immunité Bactérienne Adaptative, Science (2012). DOI: 10.1126 / science.1225829

Fourni par
Réseau Science X

© 2019 Science X Network

Citation:
                                                 Ingénierie du génome avec CRISPR / HDR pour diversifier les fonctions des anticorps produits par des hybridomes (9 septembre 2019)
                                                 récupéré le 9 septembre 2019
                                                 sur https://phys.org/news/2019-09-genome-crisprhdr-diversify-functions-hybridoma-produced.html

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